Nowatorski peptyd GmAMP w walce z opornością grzybiczą

Nowatorskie podejście w walce z opornością grzybiczą?

Badanie opisuje eksperymentalną ocenę nowego peptydu przeciwgrzybiczego GmAMP (SPGKKKKKKKKKKKTKKKKKK) przeciwko opornym na flukonazol szczepom Candida tropicalis. Naukowcy przeprowadzili kompleksową analizę laboratoryjną w celu określenia potencjału terapeutycznego tego związku.

W ramach badania przeprowadzono szereg eksperymentów in vitro na czterech klinicznych izolatach C. tropicalis opornych na flukonazol (4171, 4252, 6984 i 8402) pozyskanych z krwi pacjentów z zakażeniami oraz na szczepie referencyjnym ATCC 20962. Peptyd GmAMP został zsyntetyzowany metodą stałofazowej syntezy chemicznej przez Gil Biochemical Co., Ltd (Szanghaj, Chiny), oczyszczony za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconą fazą (RP-HPLC) do czystości >95%, a jego struktura i właściwości fizykochemiczne zostały szczegółowo scharakteryzowane. GmAMP ma strukturę α-helikalną, masę cząsteczkową 2539,35 Da, ładunek +17 i jest hydrofilowy (wartość hydrofobowości -0,757).

Wyniki wykazały, że GmAMP ma silne działanie przeciwgrzybicze przeciwko opornym na flukonazol szczepom C. tropicalis, z wartościami MIC (minimalne stężenie hamujące) w zakresie 25-50 μM, podczas gdy te szczepy wykazywały oporność na flukonazol przy stężeniach >3343 μM. Szczep referencyjny C. tropicalis ATCC 20962 był wrażliwy zarówno na GmAMP (MIC = 12 μM) jak i na flukonazol (MIC = 13 μM). Badania kinetyki wzrostu i zabijania wykazały, że GmAMP w niższych stężeniach (25 i 50 μM) spowalniał wzrost grzybów i wydłużał czas potrzebny do osiągnięcia fazy logarytmicznej, a przy wyższych stężeniach (100 μM) wykazywał działanie grzybobójcze w ciągu 2 godzin.

Jak GmAMP zakłóca strukturę komórkową?

Mechanizm działania GmAMP obejmuje zakłócenie integralności błony komórkowej grzybów, co wykazano za pomocą mikroskopii elektronowej, cytometrii przepływowej i badań przepuszczalności błony. Obserwacje mikroskopem elektronowym wykazały, że komórki traktowane GmAMP (100 μM) przez 2 godziny ulegały zniszczeniu, a ich powierzchnia stawała się chropowata i nieregularna, w przeciwieństwie do gładkich i okrągłych komórek w grupie kontrolnej. Cytometria przepływowa z barwieniem PI/SYTO9 wykazała, że GmAMP zwiększał przepuszczalność błony komórkowej w sposób zależny od dawki – przy stężeniach 25, 50 i 100 μM odpowiednio 45,02%, 76,88% i 85,02% komórek wykazywało dodatnie barwienie PI, co wskazuje na uszkodzenie błony. Peptyd powodował również depolaryzację potencjału błonowego (mierzoną sondą DiSC₃(5)) i indukował gromadzenie się reaktywnych form tlenu (ROS) w sposób zależny od dawki i czasu, co przyczyniało się do jego działania przeciwgrzybiczego.

Ponadto GmAMP skutecznie hamował transformację C. tropicalis z formy drożdżowej do strzępkowej, co jest kluczowym procesem w patogenezie zakażeń grzybiczych. W grupie kontrolnej zaobserwowano, że długość strzępek grzybni zwiększała się wraz z czasem inkubacji, a po 9 godzinach komórki drożdży tworzyły wiązki strzępek z rozgałęzieniami różnej wielkości i długości, które splatały się tworząc strukturę siatkową. Przy stężeniach 25 i 50 μM GmAMP częściowo hamował transformację morfologiczną z drożdży do strzępek, a przy stężeniu 100 μM całkowicie ją tłumił.

Szczególnie istotne było działanie GmAMP przeciwko biofilmom C. tropicalis. Peptyd skutecznie hamował tworzenie biofilmu (o 49,75%, 71,28% i 88,32% przy stężeniach odpowiednio 50, 100 i 200 μM) i wykazywał zdolność do eradykacji dojrzałego biofilmu (o 17,53%, 42,07% i 58,28% przy tych samych stężeniach). Obserwacje za pomocą konfokalnej mikroskopii laserowej potwierdziły, że GmAMP zapobiegał tworzeniu się zwartego i nienaruszalnego biofilmu, a w przypadku dojrzałego biofilmu powodował jego rozluźnienie i redukcję struktury sieciowej. Jest to ważne odkrycie, ponieważ biofilmy grzybicze są często oporne na konwencjonalne leki przeciwgrzybicze i stanowią istotne wyzwanie kliniczne.

Czy innowacyjny peptyd zmienia oblicze terapii?

Badania bezpieczeństwa wykazały, że GmAMP ma niską cytotoksyczność wobec komórek ssaczych (żywotność komórek RAW 264.7 >80% przy 200 μM) i umiarkowaną aktywność hemolityczną (35,64% hemolizy przy 200 μM). Co istotne, te stężenia są znacznie wyższe niż wartości MIC potrzebne do działania przeciwgrzybiczego (25-50 μM), co sugeruje korzystny profil bezpieczeństwa GmAMP.

Badania in vivo przeprowadzone na modelu zakażenia larw Galleria mellonella potwierdziły skuteczność terapeutyczną GmAMP. W teście toksyczności peptydu wszystkie larwy przeżyły, co sugeruje brak znaczącej toksyczności GmAMP w zakresie dawek do 32 mg/kg. Leczenie GmAMP zwiększyło przeżywalność zakażonych larw do 75% w grupie otrzymującej 32 mg/kg (w porównaniu do 40% w grupie kontrolnej, p<0,05) i znacząco zmniejszyło obciążenie grzybicze z 5,27 × 10⁸ do 6,37 × 10⁶ CFU na larwę po 24 godzinach leczenia.

Badanie to sugeruje, że GmAMP może stanowić obiecującą alternatywę dla konwencjonalnych leków przeciwgrzybiczych w leczeniu zakażeń wywołanych przez oporne na flukonazol szczepy C. tropicalis. Unikalny mechanizm działania oparty na zakłóceniu błony komórkowej może pomóc w przezwyciężeniu oporności na leki, a zdolność do zwalczania biofilmów grzybiczych dodatkowo zwiększa jego potencjał terapeutyczny. Autorzy postulują, że kationowy peptyd GmAMP może oddziaływać z ujemnie naładowanymi cząsteczkami na błonie komórkowej poprzez interakcje elektrostatyczne, co prowadzi do zwiększonej przepuszczalności błony, zmiany depolaryzacji potencjału błonowego, utraty integralności strukturalnej błony, akumulacji ROS i wycieku zawartości wewnątrzkomórkowej, co ostatecznie prowadzi do dysfunkcji błony cytoplazmatycznej i śmierci komórki.

Warto zauważyć, że C. tropicalis znajduje się na liście priorytetowych patogenów grzybiczych Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) z 2022 roku, co podkreśla znaczenie opracowania nowych strategii terapeutycznych przeciwko temu patogenowi. Według badań epidemiologicznych, C. tropicalis wykazuje większy wskaźnik oporności na flukonazol w porównaniu do innych gatunków Candida, a w Chinach odsetek izolatów C. tropicalis opornych na flukonazol stale rośnie. GmAMP został zidentyfikowany przy użyciu modelowania adaptacyjnego wielozadaniowego i adaptacji modelu w oparciu o bazy danych peptydów przeciwdrobnoustrojowych, co stanowi nowatorskie podejście do odkrywania nowych związków przeciwgrzybiczych.

Podsumowanie

Badania nad nowym peptydem przeciwgrzybiczym GmAMP wykazały jego wysoką skuteczność w zwalczaniu opornych na flukonazol szczepów Candida tropicalis. GmAMP działa poprzez zakłócenie integralności błony komórkowej grzybów, wykazując wartości MIC w zakresie 25-50 μM wobec szczepów opornych na flukonazol. Peptyd skutecznie hamuje transformację C. tropicalis z formy drożdżowej do strzępkowej oraz wykazuje znaczącą aktywność przeciwko biofilmom grzybiczym, redukując ich tworzenie nawet o 88,32%. Badania bezpieczeństwa potwierdziły niską cytotoksyczność wobec komórek ssaczych i umiarkowaną aktywność hemolityczną. Testy na modelu larw Galleria mellonella wykazały skuteczność terapeutyczną przy dawce 32 mg/kg, zwiększając przeżywalność zakażonych osobników do 75%. GmAMP stanowi obiecującą alternatywę dla konwencjonalnych leków przeciwgrzybiczych, szczególnie w kontekście rosnącej oporności C. tropicalis na flukonazol.