Azole przeciwgrzybicze zakłócają rozwój embrionalny kręgowców

Czy azole przeciwgrzybicze zagrażają rozwojowi kręgowców?

Flukonazol (FLU) – powszechnie stosowany azol przeciwgrzybiczy – oraz jego główny produkt degradacji, 1,2,4-triazol (TRI), mogą zakłócać wczesny rozwój embrionalny kręgowców poprzez ingerencję w kluczowe szlaki sygnałowe. Badanie opublikowane w Scientific Reports wykazało, że oba związki wywołują charakterystyczne malformacje u embrionów Xenopus laevis, modyfikując ekspresję genów zaangażowanych w szlaki Wnt i BMP. To istotne odkrycie w kontekście rosnącego zanieczyszczenia środowiska azolami, wykrywanymi w stężeniach nanomolowych w wodach powierzchniowych na całym świecie.

Azole, w tym flukonazol, są szeroko wykorzystywane nie tylko w medycynie (leczenie zakażeń grzybiczych u ludzi i zwierząt), ale także w rolnictwie oraz przemyśle kosmetycznym (szampony, mydła, kremy). Ich wspólną cechą strukturalną jest pierścień 1,2,4-triazolu – motyw heterocykliczny niezbędny do aktywności przeciwgrzybiczej. Jednak intensywne stosowanie tych związków skutkuje ich częstym wykrywaniem w ściekach i wodach powierzchniowych, gdzie konwencjonalne oczyszczalnie często nie usuwają ich całkowicie. Pomimo wysokiej fotostabilności i powolnej degradacji, niewiele wiadomo o ich wpływie na rozwój płazów i wyższych kręgowców.

Dlaczego Xenopus laevis jako model badawczy?

Autorzy wykorzystali afrykańską szponiastą żabę Xenopus laevis – uznany i wysoce czuły organizm modelowy w biologii rozwoju i ekotoksykologii. Płazy są szczególnie wrażliwe na zanieczyszczenia wodne ze względu na przepuszczalną skórę i wodne stadia życiowe. Xenopus charakteryzuje się zewnętrznym zapłodnieniem, szybkim rozwojem oraz wysoce konserwowanymi szlakami genetycznymi wspólnymi z innymi kręgowcami, w tym człowiekiem, co czyni go idealnym do oceny wpływu chemikaliów środowiskowych.

Embriony eksponowano w sposób ciągły od stadium Nieuwkoopa-Fabera (NF) 3 do NF 45 (120 godzin po zapłodnieniu) na trzy stężenia każdego związku: 1, 100 i 1000 µg/L. Najniższe stężenie wybrano na podstawie poziomów środowiskowych pestycydów, podczas gdy wyższe odpowiadały wartościom stosowanym w poprzednich badaniach na Danio rerio. Każdy warunek testowano w trzech powtórzeniach, po 24 embriony na grupę (jeden embrion na studzienkę płytki 24-dołkowej). Roztwory ekspozycyjne odnawiano codziennie świeżo przygotowanym pożywką.

Analizowano śmiertelność, sukces wylęgu, długość ciała, częstość malformacji oraz rytm serca. Na poziomie molekularnym oceniano ekspresję kluczowych genów zaangażowanych we wczesną embriogenezę: xbra, xolloid, β-catenin, chordin i noggin. Do analizy ekspresji genów wybrano dwa najniższe stężenia (0,1 i 1 µg/L), reprezentujące poziomy istotne środowiskowo, minimalizując jednocześnie toksyczność rozwojową.

Jakie malformacje wywołują flukonazol i triazol?

Nieeksponowane embriony kontrolne rozwijały się normalnie z prawidłowo uformowanymi głowami, regularną pigmentacją i prostą osią ciała. Natomiast embriony eksponowane wykazywały wyraźne odchylenia morfologiczne. W grupach traktowanych FLU obserwowano kilka nawracających nieprawidłowości: defekty pigmentacji (zarówno nadmierna, jak i niedostateczna pigmentacja), malformacje czaszkowo-twarzowe (zmniejszona wielkość głowy, obrzęk, w najcięższych przypadkach zniekształcone struktury przednie), obrzęk serca oraz widoczne malformacje jelit.

Ekspozycja na TRI skutkowała podobnym, ale bardziej zmiennym zakresem fenotypów. Oprócz defektów pigmentacji obserwowano: zmniejszoną odległość międzyoczną, nawet połączone oczy, oraz nieprawidłowe zwijanie jelit. Ciemniejsza pigmentacja górnej części flanki była obserwowana specyficznie przy 100 µg/L FLU. Wzorce pigmentacji w przypadku TRI były zróżnicowane, obejmując ciemne plamy, niedostateczną pigmentację i gwiaździste wzory pigmentowe nieobecne w kontrolach lub grupach traktowanych FLU.

Analiza ilościowa wykazała, że FLU powoduje nasycającą krzywą malformacji – częstość ustabilizowała się na poziomie około 40% już od najniższego testowanego stężenia (1 µg/L) i pozostawała stabilna przy wyższych dawkach. To sugeruje, że nawet niskie stężenia FLU wystarczają do wywołania zaburzeń rozwojowych i że system osiąga pułap odpowiedzi wcześnie. W przeciwieństwie do tego, TRI wykazywał wyraźny trend dawkozależny: przy 1 µg/L tylko niewielka część zwierząt wykazywała jakiekolwiek malformacje, przy 100 µg/L częstość wzrosła do około 20%, a przy 1000 µg/L około 25% kijanek wykazywało widoczne nieprawidłowości.

Jak azole wpływają na rytm serca i wzrost?

Oba związki powodowały istotne zwiększenie rytmu serca przy większości testowanych stężeń, wskazując, że rozwój serca lub regulacja autonomiczna mogą być zmienione. Co ciekawe, przy najwyższym stężeniu TRI (1000 µg/L) zaobserwowano zauważalny spadek rytmu serca, sugerujący możliwy próg toksyczny, poza którym funkcja fizjologiczna ulega pogorszeniu.

Pomiary morfometryczne ujawniły dodatkowe różnice między oboma związkami. Ekspozycja na FLU prowadziła do mierzalnego wydłużenia osi ciała, potencjalnie odzwierciedlając zaburzenia w szlakach hormonalnych regulujących wzrost oraz procesach związanych z formowaniem mezodermy i rozwojem mięśni – podobnie jak wzorce opisywane dla ekspozycji na kortyzol i bisfenol A u ryb i innych organizmów modelowych. W przeciwieństwie do tego, kijanki traktowane TRI nie wykazywały istotnych zmian w długości ciała, nawet przy wyższych stężeniach.

Które szlaki sygnałowe są zaburzone?

Aby zidentyfikować szlaki molekularne dotknięte ekspozycją na azole, autorzy przeanalizowali ekspresję wybranych genów rozwojowych metodą ilościowego PCR, koncentrując się na komponentach sieci sygnałowych Wnt i BMP. Nawet niska ekspozycja na TRI (10 µg/L) powodowała regulację w górę ekspresji xbra i xolloid, podczas gdy β-catenin, chordin i noggin wykazywały trendy wzrostowe (bez istotności statystycznej).

Te zmiany mogą odzwierciedlać aktywację szlaku Wnt/β-katenina i jednoczesne hamowanie sygnalizacji BMP poprzez jej antagonistów – chordin i noggin. Regulacja w górę xbra jest zgodna ze wzmocnioną indukcją mezodermalną, podczas gdy xolloid prawdopodobnie reprezentuje odpowiedź zwrotną próbującą przywrócić aktywność BMP poprzez degradację nadmiaru chordiny. FLU wywołał podobny profil transkrypcyjny, choć wielkość zmiany była ogólnie mniejsza i bardziej zmienna.

Xbra jest wyrażany w inwoluującej strefie brzeżnej podczas gastrulacji i jest regulowany przez sygnalizację Wnt/β-katenina. Jako regulator mezodermalny, jego podwyższenie prawdopodobnie przesuwa alokację tkanek w kierunku losów tylnych. Ta posterioryzacja może być dodatkowo wzmocniona przez zwiększony xolloid, który promuje degradację chordiny, a tym samym pośrednio zwiększa aktywność BMP w części tylnej. Te wydarzenia molekularne pomagają wyjaśnić redukcje przednie obserwowane w embrioniach, szczególnie w strukturach głowy i jelicie.

Co istotne, kilka efektorów BMP niższego rzędu – follistatin, sizzled, vent1 i vent2 – nie wykazało istotnych zmian ekspresji w żadnym z traktowań. Ta selektywna odpowiedź transkrypcyjna wskazuje, że azole specyficznie zakłócają wczesne gradienty morfogenów bez szerokiej zmiany wszystkich komponentów szlaku BMP.

Jak te odkrycia przekładają się na praktykę kliniczną?

Azole przeciwgrzybicze, szczególnie flukonazol, pozostają kluczowe w leczeniu zakażeń grzybiczych u pacjentów z obniżoną odpornością, takich jak osoby z HIV/AIDS, rakiem lub po przeszczepach narządów. Candida albicans pozostaje główną przyczyną kandydozy układowej, a pojawienie się opornych szczepów, takich jak Candida auris, stanowi dodatkowe wyzwania. Poza użyciem klinicznym, ich szeroka obecność w produktach dostępnych bez recepty, takich jak kremy i szampony, przyczynia się do trwałej ekspozycji środowiskowej i ludzkiej.

Azole działają poprzez hamowanie enzymów cytochromu P450 (np. CYP51), niezbędnych do syntezy błony grzybiczej. Jednak te same enzymy – i kaskady sygnałowe, które modulują – występują również w komórkach kręgowców. Niniejsze badanie ujawnia, że nawet rdzeń strukturalny azoli (np. TRI) może zakłócać sygnalizację rozwojową u embrionów Xenopus, z selektywnymi efektami na sieci regulacyjne Wnt i BMP.

„Nasze wyniki sugerują, że nawet proste struktury triazonowe mogą zakłócać konserwatywne mechanizmy rozwojowe i rodzą ważne pytania o bezpieczeństwo środowiskowe i zdrowotne azoli przeciwgrzybiczych” – piszą autorzy badania. Chociaż precyzyjne interakcje molekularne pozostają do wyjaśnienia, ewolucyjna konserwacja tych szlaków podkreśla możliwość podobieństw w rozwoju kręgowców, w tym ludzi.

Poprzednie badania wiązały triazole, takie jak tebukonazol, ze stresem oksydacyjnym u kręgowców, mediowanym przez reaktywne formy tlenu (ROS). ROS mogą zwiększać przepuszczalność śródbłonka i zakłócać równowagę osmotyczną, co mogłoby wyjaśniać obrzękowe fenotypy obserwowane przy ekspozycji zarówno na TRI, jak i FLU. Jest to zgodne z wcześniejszymi obserwacjami stresu oksydacyjnego związanego z obrzękiem i nieprawidłowościami serca u Danio rerio eksponowanych na flukonazol.

Co oznaczają te wyniki dla bezpieczeństwa azoli?

Badanie wykazało, że zarówno flukonazol, jak i jego główny produkt degradacji 1,2,4-triazol wykazują potencjał teratogenny u embrionów Xenopus laevis, ale poprzez częściowo różne efekty rozwojowe. FLU działa szybko i osiąga fenotypowe plateau przy niskich stężeniach (~40% malformacji już przy 1 µg/L), podczas gdy TRI indukuje malformacje w bardziej stopniowy, dawkozależny sposób (do ~25% przy 1000 µg/L). Spektrum malformacji i szersze zmiany ekspresji genów wywołane przez TRI sugerują bardziej wszechstronne zakłócenie wzorca osiowego.

Na poziomie molekularnym oba związki selektywnie modyfikują ekspresję genów zaangażowanych w szlaki Wnt i BMP – kluczowe dla wczesnej embriogenezy kręgowców. Obserwowane zmiany transkrypcyjne dostarczają prawdopodobnego mechanistycznego powiązania między zakłóceniami sygnalizacji a fenotypem, w tym redukcjami przednimi, defektami czaszkowo-twarzowymi i nieprawidłowościami serca. Flukonazol i podobne związki azolowe mogą zatem reprezentować pojawiające się zagrożenia rozwojowe i zdrowotne, wymagające bliższej eksploracji toksykologicznej i klinicznej, szczególnie w kontekście ekspozycji kobiet w ciąży i dzieci.