Biofilmy na urządzeniach medycznych – nowe rozwiązanie w walce z infekcjami

Czy biofilmy stanowią niewidzialnego wroga?

Inwazyjne urządzenia medyczne stanowią integralną część współczesnej medycyny, odgrywając kluczową rolę w ratowaniu życia i poprawie wyników leczenia pacjentów. Niestety, zakażenia tych urządzeń przez mikroorganizmy są głównym czynnikiem przyczyniającym się do infekcji szpitalnych (około 50-70% przypadków) i stanowią krytyczne wyzwanie w opiece nad pacjentem. Biofilmy, czyli zamknięte społeczności mikrokolonii otoczone zewnątrzkomórkową macierzą polimerową, mogą tworzyć się na powierzchni urządzenia już w ciągu kilku godzin od jego zastosowania. Co niepokojące, biofilmy skutecznie unikają działania antybiotyków i układu odpornościowego gospodarza, co czyni je niezwykle trudnymi do zwalczenia.

Mimo że w środowisku klinicznym stosuje się ogólnoustrojową antybiotykoterapię, biofilmy ograniczają dyfuzję antybiotyków i mogą wymagać nawet 10-1000 razy wyższych stężeń do leczenia infekcji. To zjawisko odgrywa również kluczową rolę w powszechnym pojawianiu się mikroorganizmów opornych na antybiotyki. Szczególnie niepokojący jest fakt, że szczep grzybiczy Candida albicans stanowi czwartą najczęstszą przyczynę zakażeń związanych z cewnikami naczyniowymi i trzecią najczęstszą przyczynę zakażeń związanych z cewnikami moczowymi, a dojrzały biofilm może utworzyć w czasie krótszym niż 24 godziny.

Istotnym aspektem jest także to, że klinicznie istotne infekcje rzadko są wywoływane przez pojedynczy rodzaj drobnoustrojów. Większość zakażeń ma charakter polimikrobialny i wymaga leczenia zarówno bakterii, jak i grzybów. Niestety, zakażenia grzybicze są zwykle pomijane w warunkach klinicznych, gdzie antybiotykoterapia jest złotym standardem w przypadku każdej infekcji. “Zakażenia grzybicze są zwykle pomijane w warunkach klinicznych, gdzie antybiotykoterapia jest złotym standardem dla każdej prezentowanej infekcji” – podkreślają autorzy badania.

Jak mogą pomóc flukonazol i tlenek azotu?

Flukonazol, pochodna triazolu pierwszej generacji podawana doustnie, rozpuszczalna w wodzie i nietoksyczna, jest łatwo wchłaniana i stanowi skuteczny środek przeciwgrzybiczy. Rodzina azolowych środków przeciwgrzybiczych działa poprzez hamowanie grzybiczego enzymu cytochromu P450 14 α-demetylazy, zatrzymując konwersję lanosterolu do ergosterolu. Ergosterol jest głównym sterolem błon komórkowych drożdży i grzybów, a jego brak powoduje degradację błony. Flukonazol był stosowany w leczeniu zakażeń w dializie otrzewnowej, gdzie wykazał wyższą skuteczność niż inne środki przeciwgrzybicze. Z powodzeniem stosowano go również jako leczenie przeciwgrzybicze przeciwko zakażeniom Candida u pacjentów w stanie krytycznym poddawanych operacji, a także jako leczenie profilaktyczne u noworodków o bardzo niskiej masie urodzeniowej z centralnym dostępem naczyniowym, pacjentów chirurgicznych w stanie krytycznym oraz immunosupresyjnych pacjentów po przeszczepie szpiku kostnego.

Z drugiej strony, tlenek azotu (NO), endogennie produkowany wolny rodnik, został uznany za środek przeciwbakteryjny o szerokim spektrum działania oraz środek przeciwzakrzepowy. NO bierze udział w wielu procesach fizjologicznych, w tym w rozszerzaniu naczyń, hemostazie, funkcjonowaniu śródbłonka i wspomaganiu gojenia ran. W obecności tlenu NO może wytwarzać wysoce reaktywne formy tlenu i azotu (ROS i RNS), które mogą wywierać działanie bakteriobójcze poprzez uszkadzanie białek komórkowych, DNA i lipidów. Te reaktywne formy, w tym rodnik hydroksylowy (OH–), nadtlenoazotyn (ONOO–), dwutlenek azotu (NO2) i czterotlenek diazotu (N2O4), mogą wprowadzać rozszczepienie DNA, peroksydację lipidów, uszkodzenie błony i białek, ostatecznie zabijając komórkę bakteryjną.

Wielomechanistyczny sposób działania przeciwbakteryjnego NO zapobiega rozwojowi oporności bakterii, co czyni go atrakcyjną alternatywą dla antybiotyków. Bioaktywność NO jest wysoce zależna od dawki, co sprawia, że kontrola dostarczanego ładunku NO jest krytyczna. Jednak materiały uwalniające NO wykazują jedynie umiarkowaną aktywność przeciwko zakażeniom grzybiczym. Donor NO, S-nitrozo-N-acetylo-penicylamina (SNAP), wykazał nieistotne działanie przeciwko C. albicans przy stężeniu 5 mM, które jest 10 razy wyższe niż poziomy cytokompatybilne dla komórek ssaków (∼0,5 mM).

Co ciekawe, NO wykazał synergistyczne właściwości przeciwgrzybicze z lekami przeciwgrzybiczymi na bazie azoli, takimi jak flukonazol. Jednakże, kombinowana powierzchnia polimerowa z jednoczesnym dostarczaniem tych leków i NO nie została dotąd opisana dla zastosowań biomedycznych. Wang i wsp. niedawno opisali syntezę leków azolowych uwalniających NO o różnym stopniu działania in vitro i in vivo na kryptokokowe zapalenie opon mózgowych, przy czym niektóre struktury przewyższały skutecznością flukonazol. Wykazali również, że leki uwalniające NO miały zwiększone działanie na dojrzałe biofilmy w porównaniu z flukonazolem. Jednak zaprojektowane związki były specyficzne dla danego gatunku i nie wpływały znacząco na wzrost C. albicans.

Czy innowacyjne kompozyty zmienią praktykę kliniczną?

Niniejsze badanie przedstawia nowatorską strategię projektowania cytokompatybilnego biomateriału z potencjałem jednoczesnego dostarczania przeciwbakteryjnego NO i przeciwgrzybiczego flukonazolu. Donora NO, S-nitrozo-N-acetylo-penicylaminę (SNAP), połączono z termoplastycznym silikonowym poliwęglanem uretanowym (TSPCU) o niskiej chłonności wody i pokryto warstwą termoplastycznego poliuretanu (TPU) o wysokiej chłonności wody z dodatkiem flukonazolu. W ten sposób opracowano kompozyty, które mogły jednocześnie uwalniać NO i flukonazol. Materiały te zostały poddane ocenie pod kątem zmian statycznego kąta zwilżania wodą, chłonności wody i stabilności, a następnie scharakteryzowane pod kątem uwalniania NO i flukonazolu w warunkach fizjologicznych.

W badaniu zastosowano szereg technik charakteryzujących właściwości fizyczne i chemiczne opracowanych materiałów. Przeprowadzono analizy zwilżalności powierzchni, stabilności powłoki, chłonności wody oraz dyfrakcji rentgenowskiej (XRD). Wykorzystano również mikroskopię elektronową (SEM) do badania morfologii powierzchni oraz spektroskopię ATR-FTIR i Ramana do potwierdzenia integracji związków. Zbadano także uwalnianie flukonazolu i SNAP oraz rzeczywiste uwalnianie NO w warunkach fizjologicznych.

Szczegółowe badania wykazały, że powłoka TPU na substratach TSPCU zmniejszyła kąt zwilżania wodą (WCA) ze 101,0 ± 2,9° do 88,1 ± 4,7°. Dodanie SNAP do TSPCU obniżyło WCA do 81,5 ± 3,7°, a dalsze powlekanie TPU kompozytów TSPCU-SNAP zmniejszyło WCA do 71,0 ± 9,4°, demonstrując lekko hydrofilowe właściwości powłoki TPU. Włączenie flukonazolu do międzyfazy TPU zmniejszyło kąt zwilżania wodą w sposób zależny od dawki, przy czym najniższy WCA uzyskano przy 20% wag. flukonazolu (62,7 ± 4,1°). Badania chłonności wody wykazały, że kompozyty bazowe TSPCU miały chłonność wody <2%, podczas gdy powlekanie TPU znacznie zwiększyło chłonność wody do 6,4 ± 4,0%. Dodanie SNAP do matrycy TSPCU zwiększyło chłonność wody do 4,0 ± 1,9%.

Analiza morfologii powierzchni za pomocą SEM wykazała, że kompozyty TSPCU miały gładką powierzchnię z minimalnymi cechami topograficznymi. Powłoka z TPU dodatkowo wygładzała powierzchnię. Włączenie SNAP do kompozytu TSPCU dało chropowatą powierzchnię wynikającą z krystalicznych agregatów SNAP, które tworzyły się w pobliżu powierzchni polimeru. Dalsze włączenie flukonazolu do powłoki TPU nadało powierzchni cechy, przy czym wyższe stężenia wykazywały większą teksturę powierzchni.

Jak skutecznie zwalczać patogeny?

Wytworzone kompozyty oceniono pod kątem cytokompatybilności z komórkami ssaków, a następnie właściwości przeciwbakteryjnych i przeciwgrzybiczych wobec Escherichia coli, Staphylococcus aureus i C. albicans w 24-godzinnych badaniach. Wyniki były niezwykle obiecujące.

Badania wykazały, że kompozyty SNAP-flukonazol osiągnęły redukcję 1-2 log obciążenia grzybiczego w przylegających i planktonicznych C. albicans, podczas gdy uzyskano redukcję 3-4 log dla S. aureus i redukcję 1,6-2,1 log w E. coli. Co ważne, materiał zabijał bakterie i grzyby zarówno w formach przylegających do powierzchni, jak i planktonicznych, demonstrując zdolności przeciwinfekcyjne o szerokim spektrum działania.

Szczegółowe badania przeciwgrzybicze wykazały, że SNAP miał umiarkowany wpływ na żywotność grzybów zarówno w formie przylegającej, jak i planktonicznej (odpowiednio 64,3 ± 12,4 i 46,3 ± 9,7%) w porównaniu z kontrolami. Włączenie samego flukonazolu do matrycy polimerowej ujawniło zależny od stężenia wzrost aktywności przeciwgrzybiczej w formach przylegających i planktonicznych. Kompozyty zawierające 20% wag. flukonazolu zmniejszyły ilość żywych grzybów o 97,7 ± 1,1 i 87,9 ± 1,0% odpowiednio w formach przylegających i planktonicznych w porównaniu z kontrolami TSPCU. Połączenie SNAP i flukonazolu wykazało doskonałą redukcję zarówno w planktonicznych, jak i przylegających bakteriach, porównywalną z TSPCU. Kompozyty działały lepiej przeciwko S. aureus (>3-log redukcji) niż E. coli (>1,8-log redukcji).

Ponadto, kompozyty nie wykazywały cytotoksycznego działania wobec mysich fibroblastów podczas testów in vitro, co potwierdza cytokompatybilność tego nowatorskiego biomateriału. Wszystkie kompozyty wykazały żywotność >95% w porównaniu z nieobrabianymi komórkami. Co więcej, kompozyty zawierające SNAP wykazały niewielki wzrost procentowej żywotności w porównaniu z nieobrabianymi komórkami, co można przypisać proliferacyjnym efektom NO na komórki fibroblastów, kluczowemu aspektowi związanemu z gojeniem ran.

Polimery kompozytowe uwalniały fizjologiczne poziomy NO (>0,5 × 10^–10 mol cm^–2 min^–1) przez co najmniej 72 godziny, jednocześnie zachowując rezerwuar donora SNAP wewnątrz matrycy polimerowej. Kompozyty mogły również uwalniać fungicydalne poziomy flukonazolu (>45 μg mL^–1 kumulacyjnego uwolnienia) przez 72 godziny w warunkach fizjologicznych. Te ilości są znacznie wyższe niż w poprzednich doniesieniach o materiałach uwalniających flukonazol, co można przypisać unikalnemu projektowi tego biomateriału z TPU o wysokiej chłonności wody, umożliwiającemu szybką dyfuzję flukonazolu z matrycy.

Jakie są perspektywy kliniczne?

Szczegółowa analiza kinetyki uwalniania wykazała, że niższe stężenia wagowe flukonazolu wykazywały zwiększone frakcje kumulacyjnego uwalniania przez 8 godzin, podczas gdy formuły o wyższym stężeniu wagowym, takie jak 20% wag., uwalniały proporcjonalnie niższe ilości załadowanego leku. Zostało to potwierdzone przez dopasowanie kinetyki dyfuzji do drugiego prawa dyfuzji Ficka, wykazując, że formulacja 1% wag. flukonazolu wykazywała znacznie zwiększone szybkości dyfuzji i uwalniania ładunku flukonazolu w porównaniu do wszystkich innych formulacji.

Badania uwalniania NO wykazały, że kompozyty SNAP powlekane TPU wykazywały najwyższy strumień NO w dniu 0 wynoszący 9,07 ± 4,33 × 10^–10 mol cm^–2 min^–1, który zmniejszył się do 0,78 ± 0,43 × 10^–10 mol cm^–2 min^–1 po 24 godzinach. Uwalnianie NO utrzymywało się na poziomie fizjologicznym przez 72 godziny (0,45 ± 0,20 × 10^–10 mol cm^–2 min^–1). Dodanie flukonazolu do powłoki TPU nieznacznie zmniejszyło strumień NO w dniu 0, dając 8,77 ± 1,54 × 10^–10 mol cm^–2 min^–1 NO dla kompozytów z 5% wag. flukonazolu. Najniższe uwalnianie w dniu 0 uzyskano przy kompozytach z 20% wag. flukonazolu (5,94 ± 0,81 × 10^–10 mol cm^–2 min^–1).

Czy takie podejście może zrewolucjonizować sposób, w jaki zapobiegamy zakażeniom związanym z urządzeniami medycznymi? Potencjał jest ogromny, szczególnie biorąc pod uwagę rosnący problem oporności na leki przeciwdrobnoustrojowe. Materiał ten mógłby znaleźć zastosowanie w cewnikach naczyniowych, cewnikach moczowych, implantach i innych urządzeniach medycznych, które są szczególnie narażone na tworzenie się biofilmu.

Ogólnie rzecz biorąc, badanie to przedstawia nowatorską strategię projektowania biomateriałów przeciwinfekcyjnych w celu zapobiegania infekcjom na powierzchni urządzeń, co stanowi krytyczne powikłanie w warunkach klinicznych. “Nasze wyniki sugerują, że wczesne zastosowanie tego biomateriału może znacząco ograniczyć ryzyko infekcji związanych z urządzeniami medycznymi” – zauważają badacze. Długoterminowy potencjał aplikacyjny, skalowalność i efektywność kosztowa tego materiału wymagają dalszej oceny przed rozważeniem jego przekształcenia w produkt komercyjny.

Czy jesteśmy o krok bliżej rozwiązania problemu zakażeń związanych z urządzeniami medycznymi? Czas pokaże, ale wyniki tego badania dają powody do optymizmu w walce z jednym z najbardziej uporczywych problemów współczesnej medycyny.

Podsumowanie

Badanie przedstawia innowacyjny biomateriał łączący właściwości przeciwbakteryjne tlenku azotu (NO) i przeciwgrzybicze flukonazolu. Kompozyt został stworzony poprzez połączenie donora NO (SNAP) z termoplastycznym silikonowym poliwęglanem uretanowym (TSPCU) i pokrycie warstwą termoplastycznego poliuretanu (TPU) zawierającego flukonazol. Materiał wykazał znaczącą skuteczność w zwalczaniu biofilmów, osiągając redukcję 1-2 log w przypadku Candida albicans oraz 3-4 log dla Staphylococcus aureus i 1,6-2,1 log dla Escherichia coli. Kompozyt uwalniał fizjologiczne poziomy NO przez 72 godziny, zachowując jednocześnie wysokie stężenia flukonazolu. Co istotne, materiał nie wykazywał cytotoksyczności wobec komórek ssaków. Badanie otwiera nowe możliwości w zapobieganiu infekcjom związanym z urządzeniami medycznymi, które obecnie stanowią 50-70% wszystkich zakażeń szpitalnych.