Candida glabrata – nowe wyzwanie w leczeniu grzybic

Czy Candida glabrata stanowi nowe wyzwanie w leczeniu grzybic?

Rosnąca liczba zakażeń oportunistycznych grzybami z rodzaju Candida stanowi poważne wyzwanie kliniczne, szczególnie u pacjentów z obniżoną odpornością, takich jak osoby z HIV/AIDS, chorzy na nowotwory poddawani chemioterapii oraz biorcy przeszczepów narządów. Wśród patogenów tej grupy, Candida glabrata wysuwa się na czołową pozycję, w niektórych populacjach pacjentów przewyższając częstością występowania C. albicans. Zjawisko to budzi niepokój ze względu na wrodzoną oporność C. glabrata na wiele leków przeciwgrzybiczych oraz alarmującą zdolność do nabywania oporności w trakcie leczenia, co podkreśla pilną potrzebę opracowania skutecznych strategii terapeutycznych i głębszego zrozumienia molekularnych mechanizmów leżących u podstaw tolerancji i oporności na leki.

Flukonazol (FLC) od dawna stanowi podstawę terapii przeciwgrzybiczej ze względu na szerokie spektrum działania przeciwko różnym gatunkom Candida, w tym C. glabrata. Jest powszechnie stosowany zarówno profilaktycznie, jak i terapeutycznie w leczeniu kandydozy. Jednak pojawienie się szczepów opornych na FLC stanowi znaczące wyzwanie dla skuteczności leczenia. Oprócz oporności na leki, charakteryzującej się podwyższonym minimalnym stężeniem hamującym (MIC), wprowadzono niedawno nowy termin – tolerancja przeciwgrzybicza – opisujący zdolność wrażliwych na leki szczepów grzybów do powolnego wzrostu w obecności stężeń leków przekraczających MIC. Tolerancję FLC można ocenić za pomocą testów dyfuzji dyskowej, gdzie szczepy wrażliwe na FLC wykazują wyraźną strefę zahamowania wzrostu (ZOI). W testach tych zdjęcia płytek analizowano przy użyciu pakietu diskImageR. Poziom oporności na leki mierzono na podstawie promienia ZOI (RAD), natomiast tolerancję oceniano na podstawie frakcji wzrostu (FoG) w obrębie ZOI.

Warto zauważyć, że C. glabrata jest bliżej spokrewniona z Saccharomyces cerevisiae niż z innymi gatunkami Candida, dzieląc znaczące podobieństwa genetyczne i ewolucyjne. Ta relacja wyróżnia C. glabrata w obrębie rodzaju Candida i wpływa na nasze zrozumienie jej biologii, patogenności i odpowiedzi na leczenie przeciwgrzybicze. Niedawno wykazaliśmy, że tolerancja FLC występuje w dzikich izolatach C. glabrata i może być indukowana przez ekspozycję na FLC. Ponadto, podobnie jak w przypadku C. albicans, pokazaliśmy, że tolerancja FLC w C. glabrata jest zależna od białka szoku cieplnego Hsp90 i kalcyneuryny. Jednak czynniki modulujące tolerancję FLC w C. glabrata pozostają w dużej mierze nieznane.

Czy stres ER zmienia profil oporności na FLC?

W niniejszym badaniu oceniono wpływ tunikamycyny (TUN) na tolerancję FLC w klinicznych izolatach C. glabrata. TUN jest szeroko stosowanym induktorem stresu retikulum endoplazmatycznego (ER), który hamuje UDP-N-acetyloglukozamino-dolichol fosforanu N-acetyloglukozamino-1-fosforan transferazę (GPT), blokując początkowy etap biosyntezy glikoprotein w ER. To zahamowanie prowadzi do gromadzenia się nieprawidłowo sfałdowanych glikoprotein w ER, wywołując stres ER. TUN został powiązany z opornością na leki zarówno w komórkach ssaków, jak i drożdży. W szczególności hamowanie glikozylacji przez TUN uwrażliwia wielolekooporne (MDR) komórki raka żołądka na śmierć komórkową indukowaną przez TUN, a także zwiększa wrażliwość linii komórkowych MDR na szereg środków chemioterapeutycznych. W diploidalnym patogenie grzybiczym Candida albicans, TUN indukuje amplifikację chromosomu 2, co prowadzi do zwiększenia ekspresji kilku genów związanych z tolerancją na kaspofunginę. W haploidalnym patogenie grzybiczym Cryptococcus neoformans, TUN indukuje powstawanie wielu aneuploidalnych kariotypów, a niektóre aneuploidy są krzyżowo oporne na TUN i FLC. Wcześniejsze badania wykazały, że TUN może służyć jako adjuwant do eliminacji tolerancji FLC w C. albicans, jednak mechanizm leżący u podstaw tego zjawiska pozostaje niezbadany.

W badaniach wykorzystano izolaty C. glabrata tolerancyjne na FLC (CG4 i CG8) oraz nieoporny szczep referencyjny BG2. Wyniki badania wykazały, że TUN w stężeniu 1 μg/ml skutecznie eliminuje tolerancję FLC we wszystkich trzech badanych izolatach, co manifestowało się znaczącym zmniejszeniem wartości FoG₂₀ przy zachowaniu podobnych wartości RAD₂₀. Wskazuje to, że mechanizm działania TUN jest ukierunkowany głównie na szlaki związane z tolerancją, a nie bezpośrednio na mechanizmy oporności.

Interesującym zjawiskiem zaobserwowanym podczas testowania izolatu CG4 było pojawienie się kilku wyjątkowo dużych kolonii w obrębie ZOI po zastosowaniu kombinacji TUN i FLC. Dalsze badania wykazały, że kolonie te były mutantami typu “petite”, charakteryzującymi się niedoborami oddechowymi z powodu defektów w funkcji mitochondrialnej. Mutanty te nie były w stanie rosnąć na podłożu YPG, gdzie glicerol służył jako źródło węgla. Co ciekawe, wszystkie cztery wybrane kolonie wykazały poprawę wzrostu w porównaniu do rodzicielskiego szczepu CG4 w obecności TUN, co wskazuje na możliwą adaptacyjną odpowiedź lub mechanizm kompensacyjny u mutantów petite, który zwiększa ich proliferację w obecności TUN.

Wyniki z testu dyfuzji dyskowej wykazały, że wszystkie cztery kolonie miały wyraźne ZOI o zmniejszonym ogólnym rozmiarze. Analiza ilościowa obrazów z testu dyfuzji dyskowej potwierdziła, że wszystkie cztery kolonie miały znacząco niższe wartości zarówno FoG₂₀, jak i RAD₂₀, ze statystyczną istotnością (p < 0,001, dwustronny test t-Studenta). Wyniki te łącznie wskazują, że cztery kolonie nie tylko utraciły tolerancję FLC, ale także zyskały oporność na FLC.

Aby lepiej zrozumieć wpływ samego TUN na izolat CG4, komórki rozprowadzono na płytkach YPD zawierających różne stężenia TUN. Na płytce z 16 μg/ml TUN pojawiło się kilkaset kolonii, które nazwano “adaptorami”. Spośród 16 losowo wybranych adaptorów, 12 wykazało niedobory oddechowe (nie rosły na YPG), podczas gdy pozostałe 4 zachowały zdolność oddechową. Adaptory typu petite wykazały znacząco niższe wartości RAD₂₀ i FoG₂₀ w porównaniu do szczepu rodzicielskiego, co wskazuje, że utraciły tolerancję FLC, ale jednocześnie nabyły oporność na FLC. W przeciwieństwie do tego, adaptory niebędące petite nie wykazały znaczących zmian w RAD₂₀ lub FoG₂₀ w porównaniu do szczepu rodzicielskiego.

Wrażliwość na FLC została dodatkowo oceniona poprzez określenie minimalnego stężenia hamującego (MIC). Szczep rodzicielski i adaptory TUN niebędące petite wykazały MIC wynoszące 16 μg/ml, podczas gdy adaptory petite wykazały znacznie wyższe MIC, w zakresie od 64 do 128 μg/ml.

Oprócz CG4, przetestowano również inny izolat, CG8. Stwierdzono, że TUN w stężeniu 8 μg/ml znacząco hamował wzrost CG8. Losowo wybrano dwanaście adaptorów (#1-#12), a trzy z nich (#3, #8 i #9) nie rosły na płytkach YPG. Testy dyfuzji dyskowej wykazały, że adaptory petite miały znacząco niższe wartości FoG₂₀ i mniejsze wartości RAD₂₀ w porównaniu do dzikiego typu (p < 0,001, dwustronny test t-Studenta), podczas gdy adaptory niebędące petite nie wykazały znaczących zmian w FoG₂₀ lub RAD₂₀ (p > 0,05, dwustronny test t-Studenta).

Oprócz dwóch izolatów klinicznych, przetestowano również szczep referencyjny BG2. Stwierdzono, że TUN w stężeniu 8 μg/ml znacząco hamował BG2. Z puli losowo wybranych adaptorów (#1-#30), osiem zidentyfikowano jako petite. Zarówno szczep rodzicielski BG2, jak i adaptory TUN niebędące petite wykazały wyraźne strefy zahamowania (ZOI) o podobnych wartościach RAD i FoG. W przeciwieństwie do tego, adaptory petite nie wykazały wykrywalnego ZOI, co wskazuje na wysoki poziom oporności na FLC.

Czy stres ER zaburza metabolizm i regulację genową?

Aby sprawdzić, czy mutanty petite wyselekcjonowane w różnych warunkach stresu wykazują podobne fenotypy, zastosowano również bromek etydyny (EtBr), znany inhibitor syntezy mitochondrialnego DNA. EtBr hamuje syntezę mitochondrialnego DNA (mtDNA) i indukuje degradację istniejącego mtDNA, prowadząc do konwersji drożdży z wystarczającą zdolnością oddechową do petite z niedoborem oddechowym. Wszystkie sześć losowo wybranych kolonii po ekspozycji na EtBr okazało się mutantami petite, które podobnie jak adaptory TUN wykazały zwiększoną oporność na TUN oraz utratę tolerancji FLC przy jednoczesnym wzroście oporności na FLC.

Analiza ekspresji genów wykazała, że zarówno petite indukowane przez TUN, jak i przez EtBr charakteryzowały się znacznym wzrostem ekspresji genów CDR1 i PDR1, kodujących odpowiednio transporter ABC odpowiedzialny za wypompowywanie leków z komórki oraz kluczowy czynnik transkrypcyjny aktywujący ekspresję CDR1. Jednocześnie zaobserwowano znaczące obniżenie ekspresji większości genów ERG, w tym ERG1, ERG2, ERG3, ERG6, ERG7, ERG9, ERG11, ERG24 i ERG25, odpowiedzialnych za biosyntezę ergosterolu, głównego sterolu błon komórkowych grzybów.

Ekspozycja szczepu CG4 na TUN spowodowała znaczące obniżenie regulacji wielu genów ERG, w tym ERG1, ERG2, ERG3, ERG9, ERG11 i ERG24, bez istotnego wpływu na ekspresję genów CDR1, CDR2, SNQ2 i PDR1. Wskazuje to, że TUN wpływa przede wszystkim na szlak biosyntezy ergosterolu, a nie na mechanizmy effluksowe.

Badanie to ujawnia nowy mechanizm, poprzez który stres ER indukowany przez TUN moduluje tolerancję FLC w C. glabrata. Gdy aktywowana jest odpowiedź na nieprawidłowo sfałdowane białka (UPR) z powodu nieprawidłowego fałdowania białek, komórka przekierowuje zasoby z biosyntezy steroli, aby priorytetowo traktować rozwiązanie stresu ER. Potwierdza to koncepcję, że UPR nie tylko nadzoruje fałdowanie białek, ale także wpływa na szlaki metaboliczne niezbędne dla integralności komórkowej.

Wcześniejsze badania ustaliły, że tolerancja azoli w C. albicans jest modulowana przez różne czynniki fizjologiczne, w tym temperaturę, skład medium oraz specyficzne białka, takie jak Hsp90, kalcyneuryna, V-ATPaza, a także aneuploidia. Niedawno odkryliśmy, że tolerancja FLC w C. glabrata również zależy od białka szoku cieplnego Hsp90 i kalcyneuryny. W obecnym badaniu identyfikujemy nowy czynnik – indukowany przez TUN niedobór oddechowy – który reguluje tolerancję FLC w C. glabrata, stanowiąc pierwsze tego rodzaju powiązanie.

Ergosterol, główny sterol występujący w błonach grzybów, jest syntetyzowany w ER poprzez złożony szlak obejmujący liczne enzymy kodowane przez geny ERG w drożdżach. W genomie C. glabrata geny te obejmują ERG9/CAGL0M07095g, ERG1/CAGL0D05940g, ERG7/CAGL0J10824g, ERG11/CAGL0E04334g, ERG24/CAGL0I02970g, ERG25/CAGL0K04477g, ERG26/CAGL0G00594g, ERG27/CAGL0M11506g, ERG28/CAGL0J02684g, ERG6/CAGL0H04653g, ERG2/CAGL0L10714g, ERG3/CAGL0F01793g, ERG5/CAGL0M07656g, ERG4/CAGL0A00429g. Warto zauważyć, że ERG1 i ERG11 reprezentują dwa etapy ograniczające szybkość w szlaku biosyntezy ergosterolu.

Ponadto, badanie zidentyfikowało powstawanie mutantów petite jako główny mechanizm szybkiej adaptacji do stresu ER indukowanego przez TUN w C. glabrata. Zarówno mutanty petite indukowane przez TUN, jak i przez EtBr wykazały krzyżową oporność na TUN i FLC, choć z zmniejszoną tolerancją na FLC. Obniżona ekspresja wielu genów ERG w obu typach mutantów petite wzmacnia ideę, że zaburzenia w funkcji mitochondrialnej niekorzystnie wpływają na metabolizm steroli.

Zazwyczaj mutanty petite są związane z utratą funkcji mitochondrialnej, znacząco wpływając na metabolizm komórkowy. Analiza mutantów petite indukowanych przez EtBr podkreśla podobieństwo między TUN i EtBr w promowaniu krzyżowej oporności na TUN i FLC, sugerując wspólny mechanizm adaptacyjnej odpowiedzi obejmujący dysfunkcję mitochondrialną i zmienione stany metaboliczne. Zaobserwowana redukcja ekspresji wielu genów biosyntezy ergosterolu w obu typach mutantów petite wzmacnia ideę, że zaburzenia w funkcji mitochondrialnej niekorzystnie wpływają na metabolizm steroli. Ta redukcja ekspresji kluczowych genów ERG sugeruje, że mutanty te mogą rozwijać mechanizmy kompensacyjne, aby radzić sobie ze stresem lekowym, choć odbywa się to kosztem tolerancji FLC.

Odwołanie do badań Siscar-Lewin i wsp. podkreśla, że delecja mitochondrialnej polimerazy DNA CgMIP1 wyzwala utratę funkcji mitochondrialnej i powstawanie mutantów petite, co również nadaje krzyżową oporność na TUN i FLC. Nasze odkrycia opierają się na tej pracy, wzmacniając hipotezę, że integralność mitochondrialna jest niezbędna do utrzymania zarówno biosyntezy ergosterolu, jak i tolerancji na leki w C. glabrata w warunkach stresu.

Jakie są kliniczne implikacje odkryć?

Analiza MLST wykazała, że CG4 należy do ST7, najczęstszego genotypu w Azji. Nasze badanie wykazuje, że TUN może zakłócać tolerancję FLC i indukować oporność na FLC w CG4. Biorąc pod uwagę rozpowszechnienie szczepów ST7 w Azji, odkrycia te mają prawdopodobnie szerokie zastosowanie i znaczenie dla innych szczepów ST7 w tym regionie, szczególnie w zrozumieniu, jak stres ER wpływa na tolerancję i oporność przeciwgrzybiczą. Jednak potrzebne są dalsze badania, aby sprawdzić, czy podobne mechanizmy działają w innych szczepach ST7. Takie wysiłki zapewnią głębszy wgląd w epidemiologię i leczenie zakażeń C. glabrata, szczególnie w regionach, gdzie dominuje ST7.

Odkrycia te mają istotne znaczenie kliniczne, szczególnie w kontekście leczenia zakażeń C. glabrata opornymi na azole. Zrozumienie związku między stresem ER, dysfunkcją mitochondrialną a odpornością na leki przeciwgrzybicze może prowadzić do opracowania bardziej skutecznych strategii terapeutycznych. Na przykład, kombinacja leków indukujących stres ER z azolami mogłaby potencjalnie przezwyciężyć tolerancję na azole, choć należy wziąć pod uwagę możliwość pojawienia się mutantów petite z zwiększoną opornością na leki.

Podsumowując, badanie to odkrywa nowy mechanizm, poprzez który stres ER indukowany przez TUN moduluje tolerancję FLC w C. glabrata. Ta odpowiedź na stres prowadzi do powstawania mutantów petite i redukcji biosyntezy ergosterolu. To nowe spojrzenie na związek między stresem ER, dysfunkcją mitochondrialną, opornością na leki przeciwgrzybicze i tolerancją podkreśla potencjalne kierunki rozwoju bardziej skutecznych strategii terapeutycznych przeciwko opornym szczepom grzybów.

Podsumowanie

Candida glabrata stanowi rosnące zagrożenie w leczeniu zakażeń grzybiczych, szczególnie u pacjentów z obniżoną odpornością. Badania wykazały, że stres retikulum endoplazmatycznego (ER) indukowany tunikamycyną (TUN) eliminuje tolerancję na flukonazol (FLC) w szczepach C. glabrata. Ekspozycja na TUN prowadzi do powstawania mutantów typu petite z dysfunkcją mitochondrialną, które wykazują zwiększoną oporność na FLC przy jednoczesnej utracie tolerancji. Mechanizm ten wiąże się ze znaczącym obniżeniem ekspresji genów odpowiedzialnych za biosyntezę ergosterolu oraz wzrostem ekspresji genów związanych z wypompowywaniem leków z komórki. Odkrycia te mają istotne znaczenie kliniczne, szczególnie w kontekście opracowywania nowych strategii terapeutycznych przeciwko opornym szczepom C. glabrata. Wyniki badań są szczególnie istotne w Azji, gdzie dominuje genotyp ST7, do którego należy badany szczep.