Globalna epidemia infekcji grzybiczych – zagrożenia i nowe metody leczenia

Jakie zagrożenia niesie globalna epidemia infekcji grzybiczych?

Grzybicze infekcje stanowią rosnące zagrożenie dla zdrowia publicznego na całym świecie, dotykając około miliarda osób cierpiących na powierzchniowe infekcje skóry, paznokci lub włosów. Miliony więcej cierpią z powodu grzybiczych infekcji błon śluzowych, a inwazyjne zakażenia grzybicze odpowiadają za ponad 1,5 miliona zgonów rocznie, co podkreśla poważne zagrożenie, jakie stanowią dla globalnego zdrowia. Wśród najczęstszych patogenów grzybiczych znajduje się Candida albicans, powszechny składnik ludzkiej mikrobioty, który zazwyczaj kolonizuje przewód pokarmowy, jamę ustną i skórę. Jednak kompromitacja układu odpornościowego lub dysbioza mikrobioty może prowadzić do nadmiernego wzrostu i tworzenia biofilmu, co skutkuje infekcjami związanymi z Candida, które są powiązane z takimi schorzeniami jak nieswoiste zapalenie jelit (IBD).

Obecnie w praktyce klinicznej stosuje się trzy główne klasy leków przeciwgrzybiczych: imidazole, polieny i echinokandyny. Substancje te działają na różne szlaki metaboliczne grzybów, hamując odpowiednio cytochrom P450 (CYP51), syntezę ergosterolu w błonie komórkowej grzyba oraz syntazę (1,3)-β-D-glukanu. Niestety, powszechny rozwój opornych na leki szczepów grzybów ograniczył skuteczność tych terapii, co wymaga pilnego opracowania nowych środków przeciwgrzybiczych łączących wysoką skuteczność z niską toksycznością. Wśród nowych środków przeciwgrzybiczych wchodzących do badań klinicznych znajdują się głównie małe cząsteczki, takie jak VT1129 i VT1161, które wykazują ponad 1000-krotnie większe powinowactwo wiązania do CYP51, czy SCY-078, potężny inhibitor β-1,3-D-glukan syntazy. Badania wykazały również obiecujące właściwości przeciwgrzybicze flawonoidów, szczególnie tych izolowanych z korzeni Scutellaria baicalensis, które wykazują szeroki zakres aktywności biologicznej.

W trakcie badań przesiewowych 1266 związków o znanej aktywności farmaceutycznej zidentyfikowano enoksacynę, fluorochinolonu, jako obiecujący środek przeciwgrzybiczy. Enoksacyna przedłużała przeżycie nicieni zainfekowanych C. albicans i hamowała tworzenie strzępek grzybów in vivo. To skłoniło badaczy do eksploracji potencjału przeciwgrzybiczego flawonoidów, ze względu na podobieństwo strukturalne między enoksacyną a szkieletami flawonoidów. Flawonoidy ekstrahowane z korzeni S. baicalensis wykazują szeroki zakres aktywności biologicznej, w tym działanie przeciwutleniające, przeciwzapalne, przeciwwirusowe i przeciwzakrzepowe. Co istotne, baikalein i wogonin indukują apoptozę poprzez generowanie reaktywnych form tlenu, a baikalein wykazuje działanie ochronne w mysich modelach zapalenia rogówki.

Czy wyniki badań potwierdzają wyższość baikalein nad klasycznymi terapiami?

W przeprowadzonym badaniu wykazano, że baikalein posiada silniejsze działanie przeciwgrzybicze niż baikalina. Wyniki testów minimalnego stężenia hamującego (MIC) ujawniły, że baikalein wykazuje wartości MIC₉₀ wynoszące 80 μg/ml i 160 μg/ml odpowiednio przeciwko wrażliwym i opornym na flukonazol szczepom C. albicans. W przeciwieństwie do tego, baikalina wykazała znacznie wyższe wartości MIC₉₀ wynoszące 512 μg/ml i 1024 μg/ml wobec tych samych szczepów. Nystatyna przewyższała oba związki, wykazując najwyższą aktywność przeciwgrzybiczą zarówno wobec szczepów wrażliwych, jak i opornych. Te wyniki wskazują, że baikalein posiada znacznie silniejsze działanie przeciwgrzybicze przeciwko C. albicans w porównaniu do baikaliny, z 6,4-krotnie większą zdolnością hamowania.

Co szczególnie istotne, kombinacja baikalein z flukonazolem wykazała znaczący efekt synergistyczny przeciwko opornym szczepom C. albicans. Połączenie tych dwóch substancji spowodowało znaczną redukcję wartości MIC. MIC dla baikalein zmniejszył się z 160 μg/ml do 10 μg/ml, co stanowi 16-krotny spadek, podczas gdy MIC dla flukonazolu spadł z 320 μg/ml do 2,5 μg/ml, co stanowi niezwykły 1280-krotny spadek. Obliczony indeks frakcyjnego stężenia hamującego (FICI) wyniósł 0,07, co jest wartością znacznie poniżej progu 0,5, potwierdzając wysoce istotną synergistyczną interakcję między baikalein a flukonazolem w hamowaniu opornych szczepów C. albicans.

Tworzenie strzępek (mycelium) u C. albicans jest ściśle związane z rozwojem biofilmu, wirulencją i opornością na leki. Przeprowadzone eksperymenty wykazały, że baikalein znacząco hamuje wzrost strzępek C. albicans. Proliferacja strzępek występowała intensywnie w nieobecności środków przeciwgrzybiczych, podczas gdy flukonazol wykazywał ograniczone hamowanie tworzenia strzępek. Nystatyna wyraźnie hamowała wzrost strzępek. Nawet przy stężeniu 512 μg/ml, baikalina nie była w stanie zahamować tworzenia strzępek. Jednak baikalein znacząco redukował wzrost strzępek przy stężeniu 40 μg/ml, wykazując efekty porównywalne do tych obserwowanych w grupie traktowanej flukonazolem. Gdy stężenie baikalein zwiększono do 160 μg/ml, poziom hamowania strzępek zbliżył się do tego obserwowanego dla nystatyny, wykazując zależne od stężenia hamowanie.

Podobne wyniki uzyskano dla opornych na flukonazol szczepów C. albicans. Nystatyna znacząco hamowała wzrost opornych strzępek, a hamowanie nasilało się w sposób zależny od dawki. Baikalina wykazywała jedynie częściowe hamowanie przy 256 μg/ml, a znaczące zmniejszenie wzrostu strzępek obserwowano przy 1024 μg/ml. Baikalein natomiast znacząco hamował wzrost opornych strzępek przy stężeniu 64 μg/ml, z niemal całkowitym hamowaniem osiągniętym przy 256 μg/ml. Wyniki te pokazują, że baikalein jest znacznie bardziej skuteczny w hamowaniu wzrostu strzępek C. albicans niż baikalina, co sugeruje, że wzmocniona aktywność przeciwgrzybicza baikalein może być ściśle związana z jego silnym hamowaniem tworzenia strzępek, kluczowego czynnika w rozwoju biofilmu i oporności na leki.

Jak biotransformacja i probiotyki rewolucjonizują leczenie infekcji grzybiczych?

Pomimo że baikalein wykazuje silne działanie przeciwko C. albicans i skutecznie hamuje tworzenie strzępek, jego niska zawartość w S. baicalensis ogranicza bezpośrednią ekstrakcję i zastosowanie. Baikalina, dominujący składnik S. baicalensis, występuje w ilościach 80 do 100 razy większych niż baikalein (zawartość baikaliny wynosi 3,520 ~ 11,400%, podczas gdy zawartość baikalein i wogoninu jest tak niska jak 0,073 ~ 0,247% i 0,002 ~ 0,061%). Dlatego wykorzystanie enzymów mikrobiologicznych do hydrolizy baikaliny do baikalein stanowi obiecujące podejście do zwiększenia aktywności biologicznej S. baicalensis i optymalizacji wykorzystania tego zasobu.

W celu znalezienia mikroorganizmów zdolnych do przeprowadzenia tej transformacji, zastosowano chromatografię cienkowarstwową (TLC), gdzie baikalein i baikalina wykazywały wyraźne wartości współczynnika retencji (Rf) odpowiednio 0,38 i 0,06. Granica wykrywalności dla baikalein wynosiła 100 μg/ml. Przy użyciu tej metody TLC oceniono 14 szczepów mikroorganizmów, w tym 8 gatunków grzybów, 3 szczepy drożdży i 3 szczepy bakterii kwasu mlekowego. Wstępne badania przesiewowe wykazały, że kilka szczepów wykazało zdolność do konwersji baikaliny, ale tylko Gibberella sp. CICC 2498 i L. rhamnosus były w stanie wyprodukować wykrywalne ilości baikalein. Wśród testowanych szczepów, L. rhamnosus wykazał największą powierzchnię piku dla baikalein, wskazując na jego najwyższą wydajność transformacji.

Aby zoptymalizować proces biotransformacji, przeprowadzono szczegółową optymalizację pojedynczych czynników. Metanol był używany jako rozpuszczalnik do śledzenia reakcji w czasie, ujawniając, że stężenie baikaliny zmniejszało się, podczas gdy stężenie baikalein stale rosło, osiągając maksimum po 6 dniach z wydajnością molową 82,5%. Następnie warunki transformacji zostały zoptymalizowane poprzez identyfikację idealnych źródeł węgla i azotu, a także parametrów hodowli. Optymalnym źródłem węgla okazała się laktoza w stężeniu 10 g/l, podczas gdy optymalnym źródłem azotu był trypton w stężeniu 20 g/l. Objętość napełnienia 20 ml, procent inokulacji 6% (v/v) i bufor octowy o pH 5,0 jako rozpuszczalnik maksymalizowały wydajność transformacji. Optymalne początkowe pH dla pożywki hodowlanej ustalono na 6,5.

Łącząc wcześniej zoptymalizowane pojedyncze czynniki i weryfikując wyniki dla różnych stężeń substratu, nie zaobserwowano znaczących różnic w wydajności transformacji, gdy stężenie substratu było poniżej 1 g/l. Jednak przy wyższych stężeniach substratu optymalizacja doprowadziła do znacznej poprawy wydajności molowej. W zoptymalizowanych warunkach transformacji, współczynnik konwersji molowej L. rhamnosus dla stężenia substratu 2 g/l osiągnął 72%, co jest 1,57 razy wyższe niż przed optymalizacją. W zoptymalizowanych warunkach transformacji, współczynnik konwersji molowej L. rhamnosus dla stężenia substratu 4 g/l osiągnął 66%, co jest 4,07 razy wyższe niż przed optymalizacją. Zdefiniowano 1 jednostkę aktywności enzymatycznej jako ilość enzymu wymaganą do wyprodukowania 1 μM baikalein dziennie. W optymalnych warunkach, aktywność β-glukuronidazy w L. rhamnosus wynosiła około 0,921 U/mg.

Kolonizacja probiotyczna w jelitach odgrywa kluczową rolę w poprawie flory jelitowej i promowaniu korzyści zdrowotnych. Ponieważ L. rhamnosus jest dobrze znanym probiotykiem, postawiono hipotezę, że jego połączenie z baikalein mogłoby wywierać wzmocnione działanie przeciwdrobnoustrojowe. Przeprowadzono wstępne badanie zdolności roztworu transformacyjnego L. rhamnosus, zoptymalizowanego przy stężeniu substratu 2 g/l, do hamowania C. albicans. W warunkach kontrolnych z użyciem pożywki MRS, C. albicans wykazywał normalny wzrost, z logarytmicznymi zliczeniami żywotności 7,505 w dniu 2 i 6,672 w dniu 8. W pożywce MRS uzupełnionej baikalinem, logarytmiczne zliczenia żywotności wynosiły 7,447 w dniu 2 i 6,447 w dniu 8, wskazując, że sama baikalina nie hamowała znacząco wzrostu grzybów.

Jednak w grupie hodowlanej L. rhamnosus zaobserwowano znaczne zmniejszenie liczby żywotnych C. albicans, z wartością logarytmiczną 3,845 w dniu 2 i brakiem wykrywalnych przeżywających C. albicans w dniu 8, co wskazuje na silne działanie przeciwgrzybicze L. rhamnosus. Co godne uwagi, grupa z roztworem transformacyjnym wykazała jeszcze silniejsze działanie przeciwgrzybicze, z wartością logarytmiczną 3,000 w dniu 2, która była o 0,845 niższa niż w grupie samej hodowli L. rhamnosus. Wyniki te potwierdziły, że roztwór transformacyjny posiadał wzmocnioną aktywność przeciwgrzybiczą, zgodnie z początkową hipotezą.

Co odkrywają analizy molekularne i mechanizmy działania nowych środków przeciwgrzybiczych?

W ramach badania zidentyfikowano również kluczowy enzym – β-glukuronidazę (LrGUS2) – odpowiedzialny za konwersję baikaliny do baikalein. Genomowy DNA Lacticaseibacillus rhamnosus został wyekstrahowany przy użyciu zestawu do ekstrakcji genomu. Gen uidA został amplifikowany przez PCR z primerami, a następnie ligowany do pET28a (+) i zweryfikowany przez trawienie EcoRI/HindIII. Rekombinowany plazmid został transformowany do BL21(DE3) i hodowany w pożywce LB. Ekspresja białka została indukowana za pomocą IPTG, a komórki zostały zlizowane przez ultrasonikację. Przeprowadzono SDS-PAGE w celu analizy białek rozpuszczalnych i strąconych.

Analizy bioinformatyczne wykazały, że LrGUS2 należy do rodziny glikozydaz GH2 i zawiera trzy konserwatywne domeny: domenę wiążącą cukier (reszty 17-183), domenę β-kanapkową podobną do immunoglobuliny (reszty 198-277) oraz domenę katalityczną (reszty 279-596). Kluczowe reszty katalityczne, takie jak Glu415 (reszta kwasowo-zasadowa), Tyr475 (miejsce aktywne) i Glu509 (nukleofil), były konserwatywne w LrGUS2, zgodnie z wcześniej opisanymi enzymami β-GUS. Analiza porównawcza wykazała, że LrGUS2 wykazuje 43,5% identyczności i 56,7% podobieństwa z EcGUS2 oraz 40,4% identyczności i 54,9% podobieństwa z LbGUS2, sugerując umiarkowaną homologię.

Aktywność przeciwdrobnoustrojowa probiotyków była szeroko badana pod kątem ich hamującego wpływu na różne patogeny. Na przykład, L. rhamnosus MDC 9661 wykazał hamowanie wzrostu Penicillium chrysotoxum i Penicillium plumbum, podczas gdy L. rhamnosus SCB0119 wykazał efekty hamujące przeciwko Escherichia coli ATCC25922 i Staphylococcus aureus ATCC6538. Ponadto, bezkomórkowe supernatanty (CFS) z L. rhamnosus i Lactobacillus plantarum hamowały tworzenie biofilmu C. albicans i C. tropicalis, potencjalnie z powodu metabolitów wydzielanych przez bakterie. Nasze wyniki potwierdzają te rezultaty, pokazując, że pożywka hodowlana L. rhamnosus sama znacząco hamowała wzrost C. albicans, co było widoczne przez spadek wartości logarytmicznych z 7,505 do 3,845.

Zdolność probiotyku do hamowania wzrostu grzybów, w połączeniu z silnym działaniem przeciwgrzybiczym baikalein, oferuje podwójne podejście do leczenia infekcji grzybiczych. Co ciekawe, połączony roztwór L. rhamnosus i baikalein nie wykazał znaczącej synergii, o czym świadczy fakt, że aktywność przeciwgrzybicza nie była znacząco wyższa niż w przypadku każdego z tych środków stosowanych osobno. Ten brak synergii może wynikać z różnych mechanizmów, poprzez które L. rhamnosus i baikalein wywierają swoje działanie przeciwgrzybicze. Claes i wsp. wyjaśnili, że L. rhamnosus GG wydziela główne białka Msp1 i Msp2, które odgrywają kluczową rolę w hamowaniu grzybów. Msp1, na przykład, działa jako endopeptydaza D-glutamylo-L-lizynowa, zmniejszając tworzenie strzępek poprzez aktywność hydrolazy chityny. Natomiast baikalein wydaje się celować w inne krytyczne szlaki, takie jak glikoliza i biosynteza ściany komórkowej, co sugeruje, że te dwa środki mogą nie działać wspólnie w sposób, w jaki robią to tradycyjne terapie synergistyczne.

Warto podkreślić, że baikalein wykazuje silne działanie przeciwgrzybicze in vitro przeciwko izolatom Candida krusei, z minimalnym stężeniem hamującym (MIC) wynoszącym 2,7 μg/ml. Jego mechanizm przeciwgrzybiczy obejmuje depolaryzację potencjału błony mitochondrialnej w sposób zależny od stężenia, zakłócając homeostazę mitochondrialną i hamując wzrost grzybów. Dokładny mechanizm, poprzez który baikalein hamuje tworzenie biofilmu, nie jest jeszcze w pełni zrozumiany. Li i wsp. zaproponowali, że baikalein zakłóca glikolizę, celując w białko C. albicans Eno1, potencjalnie zmniejszając efekty uboczne na komórki ludzkie poprzez selektywne wiązanie się z CaEno1. Inne potencjalne cele dla baikalein obejmują syntazę 1,3-β-D-glukanu i białka glikozylofosfatydyloinozytolowe. Te białka są istotnymi składnikami ściany komórkowej grzyba, a ich hamowanie mogłoby wyjaśniać silne działanie przeciwgrzybicze baikalein.

Wyniki tego badania podkreślają silne działanie przeciwgrzybicze baikalein, zarówno jako samodzielnego środka, jak i w połączeniu z flukonazolem, szczególnie przeciwko opornym szczepom C. albicans. Dodatkowo, probiotyk L. rhamnosus wykazał zarówno bezpośrednie działanie przeciwgrzybicze, jak i zdolność do konwersji baikaliny w baikalein, oferując dwufunkcyjną strategię terapii przeciwgrzybiczej. Udane klonowanie i charakterystyka LrGUS2 dostarcza ważnych informacji na temat procesu konwersji enzymatycznej, który mógłby być dalej optymalizowany do przemysłowej produkcji baikalein. Wyniki te nie tylko wspierają rozwój baikalein jako nowego środka przeciwgrzybiczego, ale także promują zrównoważone wykorzystanie S. baicalensis poprzez zielone technologie biotransformacji.

Podsumowanie

Infekcje grzybicze stanowią poważne globalne zagrożenie, dotykając miliarda ludzi i powodując ponad 1,5 miliona zgonów rocznie. Badania wykazały, że baikalein posiada silne działanie przeciwgrzybicze, szczególnie w połączeniu z flukonazolem, gdzie zaobserwowano znaczący efekt synergistyczny w zwalczaniu opornych szczepów Candida albicans. Baikalein skutecznie hamuje tworzenie strzępek grzybów przy niższych stężeniach niż baikalina. Odkryto, że probiotyczny szczep Lacticaseibacillus rhamnosus może efektywnie przekształcać baikalinę w bardziej aktywną formę baikalein, osiągając wydajność konwersji do 82,5%. Zidentyfikowano również kluczowy enzym β-glukuronidazę (LrGUS2) odpowiedzialny za tę transformację. Połączenie działania przeciwgrzybiczego baikalein z probiotycznymi właściwościami L. rhamnosus oferuje nowe, dwutorowe podejście do leczenia infekcji grzybiczych, szczególnie w przypadku szczepów opornych na konwencjonalne terapie.

Bibliografia

Zhai Hang, Zeng Jialing, Ma Xiaonan, Wang Fuju, Xu Wei, Song Ming and Xu Weizhuo. Baicalein as a potent antifungal agent against Candida albicans: synergy with fluconazole and sustainable production through probiotic-mediated bioconversion. Frontiers in Microbiology 2025, 16, 2900-3984. DOI: https://doi.org/10.3389/fmicb.2025.1562103.