Klonalna ekspansja Candida parapsilosis: analiza 22-letniej transmisji

Candida parapsilosis – patogen niedawno uznany przez WHO za „wysokiego priorytetu” – stanowi rosnące zagrożenie w środowisku szpitalnym. W ostatnich latach obserwuje się znaczący wzrost częstości szczepów opornych na flukonazol, co ogranicza opcje terapeutyczne i pogarsza rokowanie pacjentów. Badanie kohortowe z tureckiego szpitala uniwersyteckiego rzuca nowe światło na genetyczną strukturę tych opornych izolatów, ujawniając niepokojący wzorzec klonalnej dystrybucji.

Zespół z Bursa Uludag University przeanalizował 47 szczepów C. parapsilosis opornych na flukonazol, izolowanych z krwi pacjentów z kandydemią w okresie 22 lat (1997-2019). Wszystkie izolaty pochodziły z tego samego szpitala referencyjnego trzeciego stopnia i były przetwarzane w tej samej pracowni mikrobiologii klinicznej. Do genotypowania zastosowano metodę analizy mikrosatelitarnej z wykorzystaniem trzech markerów: CP1, CP4 i B5.

Dlaczego to istotne? C. parapsilosis wykazuje szczególną zdolność do kolonizacji powierzchni szpitalnych i urządzeń inwazyjnych, tworząc biofilmy charakteryzujące się matrycą mannan-glukan i adhezinami regulowanymi przez Bcr1/Efg1. Gatunek ten jest często izolowany ze skóry personelu medycznego i powierzchni szpitalnych, co zwiększa ryzyko przenoszenia między pacjentami. Genetyczna charakterystyka opornych szczepów może ujawnić drogi transmisji i pomóc w opracowaniu skutecznych strategii kontroli zakażeń.

Jak przeprowadzono analizę genetyczną opornych szczepów?

Badanie objęło wszystkie 47 izolaty C. parapsilosis sensu stricto z krwi pacjentów, które spełniały kryteria oporności na flukonazol (MIC ≥4 μg/mL). Zgodnie z wytycznymi CLSI M27M44S/M60, wartość MIC=4 μg/mL oznacza wrażliwość zależną od dawki, a MIC ≥8 μg/mL – pełną oporność. W badaniu wszystkie izolaty z MIC ≥4 μg/mL określono jako flukonazol-niepodatne, co znajduje potwierdzenie w badaniach wykazujących obecność genów oporności już przy tej wartości MIC.

Izolacja DNA została przeprowadzona z wykorzystaniem zestawu UltraClean Microbial DNA Isolation Kit (Qiagen), a stężenie i czystość DNA oceniono spektrofotometrycznie przy długości fali 260/280 nm. Do amplifikacji PCR zastosowano startery znakowane fluorescencyjnie dla markerów mikrosatelitarnych CP1, CP4 i B5, zgodnie z protokołem Sabino i wsp. Każda seria PCR zawierała kontrolę pozytywną (C. parapsilosis ATCC 22019) oraz kontrolę bez matrycy.

Analiza fragmentów została wykonana przy użyciu systemu CEQ 8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter), a dane porównawcze oceniono za pomocą oprogramowania CEQ 8000 w wersji 3.0. Drzewo filogenetyczne skonstruowano w programie BioNumerics 6.6 z zastosowaniem grupowania UPGMA i kategorycznego współczynnika podobieństwa. Moc dyskryminacyjną (DP) obliczono według formuły Huntera i wsp.

Jakie genotypy zdominowały populację opornych szczepów?

Analiza 47 izolatów ujawniła zaledwie sześć różnych genotypów, co wskazuje na wyraźnie ograniczoną różnorodność genetyczną. Rozkład genotypów był bardzo nierównomierny, z wyraźną dominacją dwóch głównych linii:

Genotyp 2 stanowił zdecydowanie najliczniejszą grupę – 22 izolaty (46,8%) wszystkich analizowanych szczepów. Ten genotyp był szczególnie rozpowszechniony w oddziałach chirurgii ogólnej i intensywnej terapii w latach 2017-2018. Tak wysoki udział jednego genotypu w porównaniu do średniej 5-7% reprezentacji genotypowej raportowanej przez Sabino i wsp. sugeruje znaczącą ekspansję klonalną i prawdopodobną transmisję szpitalną.

Genotyp 1 był drugim co do częstości – 11 izolatów (23,4%). W przeciwieństwie do Genotypu 2, ten wariant dominował w oddziałach wewnętrznych, szczególnie w onkologii i neurologii, w okresie 2000-2016. Rozkład czasowy i kliniczny sugeruje odmienne wzorce epidemiologiczne specyficzne dla różnych jednostek.

Pozostałe genotypy występowały znacznie rzadziej: Genotyp 3 (6 izolatów), Genotyp 4 (4 izolaty), oraz Genotypy 5 i 6 (po 2 izolaty każdy). Te rzadsze warianty były wykrywane sporadycznie w różnych oddziałach klinicznych i w zmiennych latach, co sugeruje wielokrotne punkty wejścia i niejednorodne drogi przenoszenia.

„Nasze dane ujawniają ograniczoną różnorodność genetyczną wśród izolatów C. parapsilosis opornych na flukonazol, z dominacją Genotypu 2 i Genotypu 1 w całym szpitalu przez dwie dekady – odkrycia zgodne z szpitalną klonalną obecnością” – piszą autorzy badania.

Co ujawniła analiza filogenetyczna o strukturze populacji?

Analiza dendrogramu i drzewa filogenetycznego ujawniła wyraźne wzorce grupowania, potwierdzające klonalny charakter populacji. Genotyp 2 wykazywał szczególnie zwartą i jednorodną strukturę, tworząc spójny klaster z niewielkimi odległościami genetycznymi (≤1) między izolatami. Ta zwartość sugeruje wspólne pochodzenie i potencjalną transmisję szpitalną, choć ostateczne potwierdzenie wymagałoby uzupełniającej analizy epidemiologicznej.

W przeciwieństwie do tego, Genotyp 1 wykazywał bardziej nieuporządkowaną dystrybucję genetyczną, co może wskazywać na dłuższy czas krążenia w szpitalu i większą akumulację drobnych zmian genetycznych. Genotypy 3, 4, 5 i 6, obserwowane rzadziej, wykazywały większą niejednorodność genetyczną, co jest zgodne z ich charakterem jako izolowanych lub egzogennych wprowadzeń.

Analiza trzech markerów mikrosatelitarnych ujawniła znaczące różnice w ich mocy dyskryminacyjnej. Marker CP1 okazał się niemal monomorficzny, identyfikując tylko trzy allele w zakresie 224-302 pary zasad, z liczbą powtórzeń od 1 do 40. Częstości alleli wahały się od 0,0213 do 0,9574, a moc dyskryminacyjna wyniosła zaledwie 0,0842. Co istotne, nie zaobserwowano heterozygotyczności, co potwierdza głównie klonalny, bezpłciowy cykl życiowy C. parapsilosis.

Marker CP4 wykazywał wyższy poziom różnorodności, identyfikując cztery allele (249-286 bp) z 1-19 powtórzeniami i częstościami alleli 0,0213-0,8511. W tym markerze zaobserwowano 4,25% heterozygotyczności (pojedynczy izolat heterozygotyczny), a moc dyskryminacyjna wyniosła 0,2683. Marker B5 osiągnął najwyższą moc dyskryminacyjną (0,5495), identyfikując trzy allele (140-148 bp) z 1-5 powtórzeniami i częstościami 0,1277-0,6170, jednak również bez heterozygotyczności.

Jakie są implikacje dla kontroli zakażeń szpitalnych?

Wyraźna dominacja Genotypu 2, odpowiedzialnego za niemal połowę wszystkich przypadków, ma istotne konsekwencje dla strategii kontroli zakażeń. Taki wzorzec klonalnej ekspansji jest dobrze udokumentowany w oddziałach intensywnej terapii i neonatologii, gdzie podatni pacjenci są skoncentrowani, a procedury inwazyjne – szczególnie cewniki żylne i żywienie pozajelitowe – ułatwiają klonalną dystrybucję.

Obecność Genotypu 2 szczególnie w chirurgii ogólnej i OIT w latach 2017-2018 sugeruje rozprzestrzenianie się ze wspólnego źródła lub łańcucha transmisji. Potwierdza to pilną potrzebę wzmocnienia środków kontroli zakażeń, zwłaszcza:

• Higiena rąk personelu – C. parapsilosis łatwo kolonizuje skórę pracowników ochrony zdrowia i może być przenoszona między pacjentami
• Zarządzanie cewnikami – wprowadzanie i utrzymanie linii centralnych, dezynfekcja portów oraz przygotowanie i podawanie żywienia pozajelitowego stwarza możliwości przetrwania w biofilmach i rozprzestrzeniania się na oddziale
• Polityka antybiotykowa – ciągła ekspozycja na flukonazol może faworyzować linie niepodatne na flukonazol, podczas gdy wewnętrznie wyższe wartości MIC echinokandyn dla C. parapsilosis mogą komplikować wybór terapii empirycznej

Wykrycie Genotypu 1 w onkologii i neurologii w latach 2000-2016 podkreśla odmienne wzorce epidemiologiczne specyficzne dla różnych jednostek. Oddziały te charakteryzują się immunosupresją, długimi pobytami i procedurami inwazyjnymi, co stwarza sprzyjające warunki dla utrzymywania się opornych szczepów.

Sporadyczne wykrywanie Genotypów 3-6, typowo związanych z izolowanymi lub egzogennymi wprowadzeniami, sugeruje wielokrotne punkty wejścia i niejednorodne drogi przenoszenia. To odkrycie podkreśla konieczność kompleksowego podejścia do kontroli zakażeń, obejmującego nie tylko środki wewnątrzszpitalne, ale także monitoring wprowadzania szczepów z zewnątrz.

Jakie są ograniczenia zastosowanej metody genotypowania?

Porównanie z międzynarodowymi schematami wielolokusowymi ujawnia znacząco niższą moc dyskryminacyjną uzyskaną w tym badaniu. Sabino i wsp. wykorzystali panel czterolokusowy (CP1, CP4, CP6 i B5) na 236 izolatach C. parapsilosis, raportując wartości DP około 0,85 dla CP1, 0,90 dla CP4 i 0,86 dla B5, co dało łączną DP wynoszącą 0,99 i 192 odrębne genotypy. W kontraście, obecne badanie wykazało DP tylko 0,084 dla CP1, 0,2683 dla CP4 i 0,55 dla B5, przy łącznej DP wynoszącej 0,7114.

Podobnie, Desnos-Ollivier i wsp. zidentyfikowali około 30 genotypów wielolokusowych z DP zbliżoną do 0,97 w izolatach z Francji i Urugwaju. Te podwyższone wartości DP sugerują znaczący stopień różnorodności allelicznej. Niższe metryki obserwowane w obecnym badaniu oznaczają, że wiele opornych na flukonazol izolatów posiada identyczne lub blisko spokrewnione genotypy, co wskazuje na głównie klonalną populację.

Autorzy przypisują niższą DP kilku wzajemnie niewyłączającym się czynnikom:

• Panel trzylokusowy jest z natury mniej rozdzielczy niż test czterolokusowy
• Dominacja jednego genotypu wielolokusowego przez wiele lat i oddziałów klinicznych, zgodna z klonalną dominacją i wynikającym z tego zmniejszeniem różnorodności allelicznej
• Selekcja szczepów eksponowanych na azole poprzez skupienie się na archiwalnych izolatach opornych na flukonazol z krwi
• Brak próbkowania środowiskowego i personelu, co mogło pominąć dodatkowe rezerwuary i różnorodność

Retrospektywny, jednoośrodkowy projekt badania i skupienie się na izolatach opornych na flukonazol z krwi może ograniczać uogólnienie wyników i wprowadzać selekcję w kierunku linii eksponowanych na azole. Ponadto, analiza opierała się na archiwalnych izolatach, więc degradacja DNA pozostaje potencjalnym źródłem artefaktów, choć izolaty były ponownie hodowane przed testowaniem, a każda seria PCR zawierała kontrole pozytywne i bez matrycy.

Co to oznacza dla przyszłych badań i praktyki klinicznej?

Wyniki badania podkreślają pilną potrzebę wzmocnienia środków kontroli zakażeń, szczególnie w oddziałach chirurgicznych i intensywnej terapii. Klonalna obecność Genotypu 2 przez lata 2017-2018 w kluczowych oddziałach wysokiego ryzyka wskazuje na możliwość przerywania łańcuchów transmisji poprzez ukierunkowane interwencje.

Jako pragmatyczny następny krok, schemat czterolokusowy włączający CP6 lub CP10 w połączeniu z CP1/CP4/B5 może zwiększyć moc dyskryminacyjną i zmniejszyć łączenie genotypów. Tam gdzie dostępne, MLST (multilocus sequence typing) lub sekwencjonowanie całego genomu (WGS) może dodatkowo udoskonalić szacunki pokrewieństwa i ujawnić mechanizmy oporności specyficzne dla genotypu.

Autorzy zalecają przyszłe wieloośrodkowe badania prospektywne, które powinny łączyć:

• Genomikę wysokiej rozdzielczości (cgMLST/WGS) do precyzyjnego określenia dróg transmisji
• Ukierunkowane sekwencjonowanie ERG11 i standaryzowane panele MIC dla leków przeciwgrzybiczych do analizy wzorców krzyżowej oporności
• Próbkowanie środowiskowe i personelu medycznego do identyfikacji rezerwuarów i źródeł wprowadzenia
• Zharmonizowane metryki procesowe i nadzoru do oceny wpływu interwencji kontroli zakażeń
• Metadane kliniczne pacjentów (np. ruch pokój/łóżko, współdzielenie urządzeń) do potwierdzenia epidemiologicznego powiązania przestrzenno-czasowego

Chociaż panel trzylokusowy (DP=0,7114) dostarcza mocnych dowodów molekularnych klonalnej obecności, sam w sobie nie może potwierdzić bezpośredniej transmisji bez uzupełniającej genomowej i epidemiologicznej koroboracji. Niemniej jednak, odkrycie ograniczonej różnorodności genetycznej i dominacji określonych genotypów przez dwie dekady stanowi przekonujący argument za pilnym wdrożeniem wzmocnionych protokołów kontroli zakażeń.

„Przyszłe wysiłki mające na celu pełne wyjaśnienie dynamiki transmisji powinny obejmować wieloośrodkowe, prospektywne współprace łączące genomikę wysokiej rozdzielczości z próbkowaniem środowiskowym i personelu oraz zharmonizowane metryki procesowe” – konkludują autorzy.

Czy trzy markery wystarczą do monitorowania oporności szpitalnej?

Analiza 47 szczepów Candida parapsilosis opornych na flukonazol, izolowanych przez 22 lata, ujawniła wyraźnie ograniczoną różnorodność genetyczną z dominacją dwóch głównych genotypów. Genotyp 2, odpowiedzialny za 46,8% przypadków, wykazywał szczególnie zwartą strukturę genetyczną i koncentrował się w oddziałach chirurgii i intensywnej terapii w latach 2017-2018, co sugeruje klonalną ekspansję i potencjalną transmisję szpitalną.

Panel trzylokusowy (CP1, CP4, B5) wykazał łączną moc dyskryminacyjną DP=0,7114 – znacznie niższą niż ~0,99 raportowaną dla schematów czterolokusowych. To ograniczenie podkreśla potrzebę rozszerzenia narzędzi genotypowych w przyszłych badaniach, szczególnie poprzez dodanie czwartego markera lub zastosowanie MLST/WGS. Niemniej, uzyskane wyniki dostarczają przekonujących dowodów na długoterminową obecność opornych klonów w środowisku szpitalnym.

Odkrycia te mają bezpośrednie implikacje dla praktyki klinicznej, podkreślając pilną potrzebę wzmocnienia kontroli zakażeń – szczególnie higieny rąk, zarządzania cewnikami i racjonalnej polityki antybiotykowej. Przyszłe wieloośrodkowe badania prospektywne łączące genomikę wysokiej rozdzielczości z próbkowaniem środowiskowym i szczegółowymi danymi epidemiologicznymi są niezbędne do pełnego wyjaśnienia dróg transmisji i mechanizmów oporności specyficznych dla genotypu.