Laktylacja białek w mechanizmie tolerancji Candida albicans na leki

Czy Candida stanowi poważne zagrożenie?

Inwazyjne zakażenia Candida stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia ludzkiego, z około 700 000 przypadkami rocznie na całym świecie. Są one powszechną przyczyną zakażeń krwi u pacjentów na oddziałach intensywnej terapii, a Candida albicans pozostaje głównym patogenem inwazyjnej kandydozy w większości regionów świata. Te organizmy komensalne w zdrowym organizmie mogą, gdy bariera skórna zostaje naruszona lub funkcja immunologiczna gospodarza osłabiona, migrować przez tkanki nabłonkowe i przedostawać się do krwiobiegu, powodując inwazyjne infekcje o wysokiej śmiertelności. Wskaźniki śmiertelności kandydemii wynoszą od 40% do 70% u dorosłych i od 20% do 34% u noworodków.

Obecnie opcje leczenia zakażeń C. albicans ograniczają się głównie do azoli, polienów i echinokandyn, ale wraz z rozpowszechnieniem ich stosowania klinicznego pojawia się coraz więcej opornych szczepów. Co więcej, często występują przypadki opóźnionego wyzdrowienia i nawrotów, nawet przy stosowaniu leków, na które patogen wykazuje wrażliwość, zwłaszcza u pacjentów z obniżoną odpornością, u których może rozwinąć się przetrwała kandydemia. Śmiertelność w przypadku przetrwałej kandydemii jest znacząco wyższa niż w przypadku infekcji nieprzetrwałych, co stwarza większe wyzwania w kontrolowaniu zakażeń ogólnoustrojowych. Ta rozbieżność między skutecznością kliniczną a niskim poziomem oporności może wynikać z tolerancji na leki przeciwgrzybicze, definiowanej jako zdolność wrażliwych na leki szczepów grzybów do wzrostu w obecności leków przeciwgrzybiczych w stężeniach powyżej minimalnego stężenia hamującego (MIC).

Czy mechanizmy oporności i epigenetyka odsłaniają nowe perspektywy?

W literaturze terminy oporność i tolerancja są często używane zamiennie. Jednak trwałe podwyższenie MIC spowodowane nieodwracalnymi mutacjami genetycznymi jest głównym mechanizmem i przejawem oporności na leki, podczas gdy tolerancja na leki jest przejawem heterogeniczności fenotypowej właściwej dla danego izolatu. Obecnie uznaje się, że mechanizmy leżące u podstaw tolerancji przeciwgrzybiczej są złożone i dynamiczne, obejmując odwracalne modyfikacje epigenetyczne, aneuploidię i duplikacje chromosomowe. Wśród nich odwracalna regulacja epigenetyczna jest nadal uważana przez kilka autorytatywnych badań za odgrywającą centralną rolę w mediowaniu tolerancji, choć konkretne procesy regulacyjne pozostają niejasne.

W ostatnich latach epigenetyka stała się prominentnym obszarem badań w zakresie nowotworów, stanów zapalnych i chorób neurodegeneracyjnych, jednak pozostaje niewystarczająco zbadana w kontekście zakażeń grzybiczych u ludzi. Modyfikacje epigenetyczne są odwracalne i dynamicznie regulują ekspresję genów przez wyspecjalizowane enzymy modyfikujące. W porównaniu z epigenetyką DNA, modyfikacje potranslacyjne białek (PTM) wpływają na ekspresję genów poprzez oddziaływanie na reszty aminokwasowe, takie jak lizyna w histonach. Literatura dokumentuje ponad 300 typów PTM, w tym metylację, acetylację, sukcynylację, fosforylację i krotonylację. Ostatnie badania wykazały, że PTM są szeroko zaangażowane w regulację wirulencji i adaptację metaboliczną C. albicans, ze szczególnym wzbogaceniem w enzymach metabolicznych regulujących biosyntezę aminokwasów i szlaki metabolizmu węgla. Wcześniejsze badania wykazały również, że acetylacja dynamicznie reguluje wrażliwość C. albicans na azole, odkrywając przejściową regulację w górę genów deacetylazy histonowej HDA1 i RPD3 podczas wczesnej ekspozycji na flukonazol, gdy wartości MIC pozostają wrażliwe.

Jak laktylacja wpływa na tolerancję na leki?

Laktylacja lizyny (Kla), nowa PTM, została początkowo zidentyfikowana w rdzeniowych histonach ssaków i bezpośrednio promuje aktywację transkrypcji analogicznie do acetylacji. Kolejne badania wykryły Kla zarówno w histonach, jak i w białkach niehistonowych w komórkach ssaków i grzybów fitopatogennych. Ta PTM została szeroko scharakteryzowana w nowotworach i chorobach neurodegeneracyjnych, gdzie napędza przebudowę mikrośrodowiska guza, unikanie odpowiedzi immunologicznej i przeprogramowanie metaboliczne, ułatwiając progresję choroby. Ostatnie postępy w technologiach proteomicznych przyspieszyły badania nad rolą laktylacji w patogenezie mikrobiologicznej. Pojawiające się badania wykazują, że laktylacja reguluje patogenność poprzez modulowanie determinantów wirulencji, unikanie odpowiedzi immunologicznej i przeprogramowanie metaboliczne w patogennych mikroorganizmach. Jednak biologiczne znaczenie laktylacji w C. albicans pozostaje całkowicie niezbadane.

W omawianym badaniu naukowcy systematycznie scharakteryzowali biologiczne znaczenie laktylacji w C. albicans i tolerancji na leki poprzez wzbogacenie peptydów modyfikowanych Kla w połączeniu z metodą wysokorozdzielczej LC-MS/MS. Praca ta dostarcza pierwszego kompleksowego obrazu laktylomu C. albicans.

Badacze przeanalizowali szczep C. albicans Ca1, pozyskany od pacjenta z AIDS, który doświadczył 14 epizodów kandydozy jamy ustnej i był leczony stopniowo zwiększanymi dawkami flukonazolu. Szczep ten rozwinął oporność na azole w ciągu dwóch lat i został udokumentowany w serii 17 izolatów C. albicans, przy czym Ca1 był izolatem początkowym. Aby zebrać komórki tolerancyjne Ca1 (komórki Ca1-T) i komórki rodzicielskie, inkubowano szczep Ca1 w 37°C przez 48 godzin na pożywce YPD zawierającej 32 μg/mL flukonazolu (FLC) i na pożywce kontrolnej bez FLC.

Poprzez testy mikrorozcieńczeń w bulionie, MIC₅₀ komórek rodzicielskich Ca1 wynosił 0,125 μg/mL, podczas gdy MIC₅₀ komórek tolerancyjnych Ca1 (Ca1-T) był identyczny z MIC₅₀ komórek rodzicielskich. Wzrost ponad MIC (SMG) Ca1, określony ilościowo po 48 godzinach, był zgodny z obserwowanym wzrostem śledzeniowym Ca1. Poprzez testy dyfuzji dyskowej, RAD₂₀ Ca1 był zgodny z MIC₅₀, a FoG₂₀ Ca1 był zgodny z SMG. Do walidacji wskaźników tolerancji mierzonych powyższymi dwiema metodami wykorzystano test E.

Co ujawniają badania proteomiczne w Candida?

Wyniki badań proteomicznych wykazały imponującą skalę modyfikacji laktylacyjnych w C. albicans. Zidentyfikowano 10 169 miejsc modyfikacji na 1 991 białkach, z czego 7 233 miejsca na 1 608 białkach posiadały informacje ilościowe, co stanowi 10,99% całkowitej liczby białek (1 608/14 633) w C. albicans. W spektrum LC-MS/MS zauważono znaczącą liczbę pasm białkowych obejmujących szeroki zakres masy peptydowej. Ilościowe określenie błędów masy wykazało dystrybucję bliską zeru, głównie <10 ppm, wskazując na dobrą jakość danych. Spośród tych 1 608 białek, 554 zawierały tylko jedno miejsce laktylacji, a 204 zawierały więcej niż 10 miejsc laktylacji. Na przykład białko A0A1D8PF42, kodowane przez gen orf19.2296, posiada najwyższą liczbę miejsc Kla, wynoszącą 69. Dodatkowo, na białku szoku cieplnego 90 (Hsp90), Erg11 i Cdr1, które są białkami związanymi z odpowiedzią na leki, znajduje się odpowiednio 34, 12 i 3 miejsca laktylacji.

Aby zrozumieć ogólną dystrybucję laktylacji w C. albicans, badacze porównali ilość zidentyfikowanych laktylowanych białek w swoim badaniu z tymi zgłoszonymi dla innych prokariontów i eukariontów, w tym grzybów (Botrytis cinerea i Phialophora verrucosa), nasion ryżu (Oryza sativa), pasożytów pierwotniaków (Toxoplasma gondii i Trypanosoma brucei), mysich komórek Kupffera (KCs) i ludzkich komórek raka wątrobowokomórkowego (HCC). Na podstawie danych widać, że C. albicans wykazuje najwyższą liczbę miejsc i białek laktylacji.

Czy sekwencyjne wzorce kryją funkcjonalne tajemnice?

Analizy motywów sekwencyjnych wokół laktylowanych lizyn wykazały 25 zachowanych motywów, z dominującymi sekwencjami A*Kla (634 peptydy), GKla (515 peptydów), AKla (473 peptydy), Kla****A (422 peptydy) i A**Kla (375 peptydów), gdzie Kla oznacza laktylowaną lizynę, a każda gwiazdka reprezentuje pojedynczą resztę aminokwasową. Mapy cieplne sekwencji aminokwasowych pokazały, że lizyna (K) była szczególnie podatna na laktylację, gdy poprzedzającymi aminokwasami były hydrofobowa alanina (A) i neutralna glicyna (G). Zaobserwowano również, że reszty A, G i walina (V) były wzbogacone w pozycjach -10 do +10, podczas gdy reszty K i arginina (R) były znacząco wzbogacone w pozycjach -10 do -5 i +5 do +10. Ten podpis przypomina wzorce sekwencyjne obserwowane w sukcynylomu i 2-hydroksyizobutyrylomu C. albicans, sugerując, że te PTM mogą wykorzystywać te same enzymy do inicjacji i odwrócenia tych odrębnych modyfikacji.

Funkcjonalna analiza zmodyfikowanych białek wykazała, że typowo modulują one szlaki uczestniczące w translacji, metabolizmie, biogenezie i PTM w C. albicans. Białka laktylowane są głównie zaangażowane w procesy komórkowe (80,41%), procesy metaboliczne (68,53%) i regulację biologiczną (33,27%). Jeśli chodzi o funkcję molekularną, białka laktylowane są głównie wzbogacone w dwóch aspektach: aktywności katalitycznej (45,27%) i wiązaniu (42,54%). Klasyfikacja oparta na COG pokazała, że białka laktylowane są szeroko zaangażowane w translację, strukturę rybosomalną (12,8%), PTM, obrotowość białek i chaperony (10,1%).

Jakie szlaki metaboliczne są aktywowane przez modyfikacje?

Następnie przeprowadzono analizy wzbogacenia funkcjonalnego w oparciu o GO. Analiza wzbogacenia procesu biologicznego ujawniła, że większość laktylowanych białek była zaangażowana w biosyntezę peptydów i procesy metaboliczne, proces biosyntezy amidów i proces metaboliczny nukleozydofosforanów. Zgodnie z analizą wzbogacenia składników komórkowych, laktylowane białka były głównie zlokalizowane w rybosomie i macierzy mitochondrialnej. Analiza wzbogacenia funkcji molekularnej dostarczyła dowodów, że znaczna liczba białek Kla była związana ze strukturalnym składnikiem rybosomu i aktywnością oksydoreduktazy, wspierając wyżej wymienione ustalenia. Ponadto, znaleziono również znaczące wzbogacenia aktywności ligazy, wiązania związanego z translacją, aktywności czynnika translacji, aktywności aminoacylo-tRNA ligazy i aktywności ligazy tworzącej związki pokrewne (np. tworzące wiązania węgiel-tlen) zaangażowane w proces translacji białka, które odgrywają kluczowe role w pomyślnym zakończeniu syntezy białka. Wzbogacenie funkcjonalne ujawniło, że Kla jest istotna w białkach rybosomalnych, sugerując potencjalnie znaczące połączenie między laktylacją a funkcjami rybosomalnymi.

W analizie wzbogacenia szlaków KEGG, laktylowane białka były wzbogacone w rybosomie, biosyntezie antybiotyków, biosyntezie aminokwasów i metabolizmie węgla. Dodatkowo, laktylowane białka były również znacząco wzbogacone w istotnych metabolizmach, w tym cyklu TCA, glikolizie/glukoneogenezie i metabolizmie pirogronianu. Ustalenia te wskazują, że laktylowane białka odgrywają ważną rolę w szlaku rybosomalnym i metabolizmach mitochondrialnych. Analiza wzbogacenia domen dalej ujawniła, że rodzina aldo/keto reduktazy, rodzina metalopeptydazy (M24), białko rybosomalne (rodzina L7Ae/L30e/S12e/Gadd45), dehydrogenaza izocytrynianu/izopropylomaleinianu i rdzeń histonowy (H2A/H2B/H3/H4) były wysoce wzbogacone w C. albicans. Wyniki wskazały, że laktylowane białka są szeroko zaangażowane w translację, metabolizm i produkcję energii.

Jakie znaczenie mają modyfikacje histonowe i ich współdziałanie?

W poprzednich badaniach zidentyfikowano, że kilka gatunków eukariotycznych i prokariotycznych posiada miejsca histonowe modyfikowane przez laktylację, które, jak zaobserwowano, bezpośrednio zwiększają ekspresję genów. Profilowanie laktylomu ujawniło rozległe laktylowane białka histonowe (szczególnie w H2A/H2B/H3/H4) w C. albicans. Aby zbadać, czy Kla, krotonylacja lizyny (Kcr), acetylacja lizyny (Kac), 2-hydroksyizobutyrylacja lizyny (Khib) i sukcynylacja lizyny (Ksuc) mogą współistnieć na pojedynczej reszcie lizyny i wywierać podobne funkcje, porównano lizynowy laktylom z 2-hydroksyizobutyrylem, acetylemem, krotonylemem i sukcynylemem uzyskanymi w poprzednich badaniach. Interesująco, 30 z 42 (71,4%) laktylowanych miejsc histonowych współwystępowało z dodatkowymi modyfikacjami, ujawniając, że wielokrotnie modyfikowane reszty lizyny dominowały nad wyłącznie laktylowanymi miejscami. H2B.1 (K82 i K88) wykazuje kombinacyjne Kla, Kcr, Ksuc i Khib, podczas gdy H4 (K61 i K93) niosło Kla z Kac, Kcr i Khib. Co godne uwagi, ewolucyjnie zachowane miejsca histonowe, w tym H2B.1K22/K46, H4K33 i H3K23/K79, wykazywały wzorce wieloakrylacji wykraczające poza laktylację. W szczególności H3K23 – dobrze scharakteryzowany hotspot epigenetyczny – zawierał jednoczesne Kla, Kac i Khib w C. albicans, podczas gdy H3K79, zachowany węzeł modyfikacji, wykazywał współwystępujące Kla, Kcr i Khib. Ta kombinacyjna sieć modyfikacji implikuje funkcjonalną koordynację crosstalku akrylacji w regulowaniu dostępności chromatyny podczas specyficznych procesów biologicznych w C. albicans.

Na podstawie acetylemu, sukcynylemu, krotonylemu i 2-hydroksyizobutyrylemu, przeprowadzono analizę interakcji białko-białko (PPI) dla laktylowanych białek, co skutkowało wygenerowaniem 87 klastrów. Sieć PPI używała wszystkich laktylowanych białek jako węzłów, bezpośrednio łącząc je z 980 białkami poprzez interakcje fizyczne i funkcjonalne. Wśród tych 980 laktylowanych białek, 136 z nich jednocześnie zawiera cztery inne PTM. Najbardziej rozlegle modyfikowane 10 białek to: Hsp90, Ssa1, Eno1, Eft2, Cef3, Fas1, Ssb1, Ssc1, Met6 i Ssa2, które przede wszystkim wykonują aktywność translacyjną i odpowiadają na bodźce i stresy.

Jak zmiany w laktylacji wpływają na sieci białkowe i funkcje komórkowe?

Badacze dalej wykazali występowanie laktylacji, acetylacji, sukcynylacji, krotonylacji i 2-hydroksyizobutyrylacji w czterech wysoce połączonych klastrach i trzech kluczowych szlakach metabolicznych: rybosomie, fosforylacji oksydacyjnej i proteasomie. W tych laktylowanych białkach, 74 białka rybosomalne są skategoryzowane do klastra 1, wśród których 22 białka rybosomalne zawierają pięć modyfikacji, podczas gdy 23 białka uczestniczą w biogenezie rybosomu i są zgrupowane w klastrze 2, z 16 białkami jednocześnie przechodzącymi 2-hydroksyizobutyrylację, krotonylację i laktylację. Ponadto, 27 laktylowanych białek jest zgrupowanych w klastrze 3, związanym z aktywnością proteasomu, a 16 laktylowanych białek jest skategoryzowanych do klastra 6, ściśle związanego z fosforylacją oksydacyjną. Co ciekawe, 85% (23/27) białek jest modyfikowanych przez więcej niż trzy rodzaje modyfikacji jednocześnie w klastrze 3, podczas gdy 88% (14/16) białek jest modyfikowanych przez trzy lub więcej modyfikacji w klastrze 6. Wiele laktylowanych białek jest zaangażowanych w różnorodne procesy komórkowe i PPI. Na przykład, białka rybosomalne Rpl82 i Rpl8b wykazują najsilniejsze powiązanie z innymi białkami w klastrze 1. Tdh3 w klastrze 6 odgrywa kluczową rolę w szlaku fosforylacji oksydacyjnej, podczas gdy Rps3 w klastrze 1 służy jako kluczowy składnik rybosomu, odgrywając istotną rolę w procesach translacji.

Oceniono kompleksowy poziom mleczanu białkowego i zaobserwowano znaczące różnice w laktylacji między Ca1 a Ca1-T, wskazując na potencjalną rolę laktylacji białek w rozwoju tolerancji na leki przeciwgrzybicze. W sumie, 91 różnicowo laktylowanych białek (DLP) i 126 miejsc modyfikacji było regulowanych w górę, podczas gdy 371 DLP i 540 miejsc modyfikacji było regulowanych w dół w Ca1-T w porównaniu z Ca1.

Funkcje biologiczne dotknięte przez DLP na podstawie adnotacji GO ujawniły, że DLP są głównie zaangażowane w procesy komórkowe i metaboliczne, regulację biologiczną, odpowiedź na bodźce i aktywność katalityczną. Klasyfikacja oparta na COG ujawniła, że DLP były głównie skoncentrowane w translacji, strukturze i biogenezie rybosomalnej, produkcji i konwersji energii oraz modyfikacji potranslacyjnej, obrocie białek i chaperonach. Prognoza lokalizacji subkomórkowej pokazała, że DLP głównie lokalizują się w jądrze, cytoplazmie i mitochondriach.

Analiza klastrowania oparta na wzbogaceniu GO DLP ujawniła, że znacząco regulowane w dół DLP były głównie związane z procesem biosyntetycznym i metabolicznym alkoholu, procesem biosyntetycznym organicznych związków hydroksylowych, procesem biosyntezy sterolu/steroidu, wiązaniem i aktywnością katalityczną oraz kompleksem spliceosomalnym po uwolnieniu mRNA (Q1, <0,667-krotnie). Przeciwnie, wyraźnie regulowane w górę DLP wykazywały wzbogacenie w aktywność dehydrogenazy glutaminianowej [NAD(P)+], aktywność monooksygenazy, rybosom i błonę komórkową (Q4, >1,5-krotnie). DLP w grupie Q2 (0,667~0,769-krotnie) wykazywały znaczące wzbogacenie w metabolizm kwasów organicznych, glikolizę/glukoneogenezę, metabolizm pirogronianu i generację ATP, wraz z funkcjami molekularnymi, w tym aktywnością transferu elektronów, aktywnością dehydrogenazy aldehydowej/alkoholowej (NAD+) i aktywnością hydrolizującą glutaminę. DLP w grupie Q3 (1,3~1,5-krotnie) były głównie wzbogacone w aktywność transportera przezbłonowego węglowodanów. Wyniki analizy klastrowania opartej na wzbogaceniu szlaku KEGG pokazały, że regulowane w dół DLP były głównie związane z glikolizą/glukoneogenezą, biosyntezą aminoacylo-tRNA i metabolizmem węgla, podczas gdy szlak metabolizmu azotu, biosynteza ubichinonu, szlak pentozo-fosforanowy i rybosom były znacząco regulowane w górę w Ca1-T. Ustalenia te wskazują, że Kla może potencjalnie regulować homeostazę metabolizmu energetycznego poprzez regulowanie w dół szlaków glikolizy/glukoneogenezy i centralnego metabolizmu węgla i jednocześnie regulowanie w górę szlaków odpowiedzi na stres antyoksydacyjny, tym samym zwiększając zdolność komórkową do przetrwania w warunkach stresu lekowego.

Czy zmiany laktylacji modulują odpowiedź na stres lekowy?

Analiza klastrowania oparta na wzbogaceniu domen białkowych wykazuje, że DLP związane z domenami dehydrogenazy glutaminianu, leucyny, fenyloalaniny i waliny oraz domenami rdzenia histonowego (H2A/H2B/H3/H4) są znacząco regulowane w górę, podczas gdy pudełko HMG (grupa wysokiej mobilności), C-końcowy EF-Tu i domena AAA (podrodzina Cdc48) są wyraźnie regulowane w dół.

Aby dalej zwalidować te ustalenia, przeprowadzono analizę immunoblot za pomocą przeciwciała pan-Kla, aby porównać poziomy laktylacji między komórkami tolerancyjnymi, rodzicielskimi i opornymi. Wyniki ujawniły znacząco podwyższony poziom laktylacji w komórkach tolerancyjnych w stosunku do komórek rodzicielskich, podczas gdy nie zaobserwowano znaczącej różnicy między komórkami opornymi na leki a komórkami rodzicielskimi.

Szczególnie interesujące okazały się modyfikacje histonów. W badaniu zidentyfikowano 42 miejsca Kla na histonach C. albicans, liczba znacznie wyższa niż te raportowane u ludzi (26 miejsc Kla na histonach), myszy (16 miejsc Kla na histonach) i innych organizmów. Co godne uwagi, kilka reszt lizyny histonowej wykazywało wiele współistniejących PTM, sugerując potencjalny crosstalk między laktylacją a innymi modyfikacjami, takimi jak acetylacja i metylacja. Wśród nich H3K79 – miejsce wcześniej implikowane w regulacji transkrypcyjnej – wykazywało zwiększoną laktylację w komórkach tolerancyjnych, podnosząc możliwość, że Kla w tej pozycji może przyczyniać się do ekspresji genów adaptacyjnych na stres. Równolegle, laktylacja H3K23, która jest uznawana za kluczowy marker epigenetyczny w systemach ssaków, również okazała się znacząco podwyższona w komórkach tolerancyjnych, wspierając jej potencjalne zaangażowanie w adaptację przeciwgrzybiczą. Ponadto, zidentyfikowano również laktylację H3K56 i H4K10, przy czym laktylacja H3K56 jest znana jako regulowana przez transporter glukozy 3 (Glut3) i odgrywa znaczącą rolę w inwazji i przerzutach raka żołądka. Co godne uwagi, laktylacja H4K10, wcześniej niezgłoszona w innych gatunkach, była regulowana w dół w komórkach tolerancyjnych, sugerując, że specyficzne znaczniki Kla mogą różnicowo modulować odpowiedzi związane z chromatyną pod presją przeciwgrzybiczą. Te ustalenia zbiorowo wskazują na potencjalną rolę regulacyjną laktylacji histonowej w epigenetycznej kontroli tolerancji i patogeniczności C. albicans, chociaż dalsze badania mechanistyczne są potrzebne do weryfikacji tych implikacji funkcjonalnych.

Oprócz histonów, liczne białka niehistonowe związane z wirulencją C. albicans i odpowiedzią na leki okazały się laktylowane. Na przykład, 34 miejsca Kla wykryto na Hsp90, kluczowym czynniku odpowiedzi na stres i tolerancji. W komórkach tolerancyjnych, trzy miejsca na Hsp90 były obniżone, podczas gdy jedno miejsce było podwyższone, sugerując regulację specyficzną dla miejsca. Podobnie, 69 miejsc Kla zidentyfikowano na białku A0A1D8PF42 (kodowanym przez gen orf19.2296), białku podobnym do mucyny potencjalnie zaangażowanym w adaptację na stres lekowy, z dwoma miejscami podwyższonymi i sześcioma obniżonymi w komórkach tolerancyjnych. Ssa1, nowy niezbędny dla endocytozy komórek nabłonkowych i zakażenia ogólnoustrojowego, zawierał 40 miejsc Kla, z których większość była regulowana w dół w komórkach tolerancyjnych, wskazując na możliwą rolę w modulowaniu interakcji gospodarz-patogen. Mkc1, składnik szlaku MAPK związany z regulacją tworzenia strzępek i biofilmu w C. albicans, był również laktylowany. Białko A0A1D8PF90 (kodowane przez orf19.5281), homolog Scp160 zaangażowanego w wyciszanie telomerowe i stabilność genomu, wykazywało 36 miejsc Kla. Przerwanie scp160 nie jest śmiertelne, ale skutkuje komórkami o zmniejszonej żywotności, nieprawidłowej morfologii i zwiększonej ploidalności komórek i zawartości DNA. W porównaniu do komórek rodzicielskich, laktylacja w sześciu miejscach na tym białku była regulowana w dół w komórkach tolerancyjnych. Ponadto, miejsca laktylacji zidentyfikowano na Erg11, Erg3, Erg5, Cdr1 i Mrr1, białkach ściśle związanych z opornością na leki w C. albicans. Warto zauważyć, że Erg3 i Cdr1 wykazywały zmniejszone poziomy Kla w komórkach tolerancyjnych, podczas gdy mieszaną regulację zaobserwowano na Erg11 i Erg5. Wyniki te sugerują, że laktylacja może wpływać na wiele szlaków związanych z tolerancją. Wreszcie, analiza sieci PPI wskazuje, że laktylowane białka prawdopodobnie tworzą moduły kooperacyjne, szczególnie w procesach związanych z opornością na leki i wirulencją C. albicans.

Czy zmiany laktylacji modulują odpowiedź na stres lekowy?

Wcześniejsze badania wykazują, że zwiększona glikoliza i akumulacja mleczanu w komórkach nowotworowych są proporcjonalne do stopnia laktylacji, który jest ściśle związany z nowotworzeniem i opornością na leki. W omawianym badaniu, białka laktylowane były znacząco wzbogacone w centralnych szlakach metabolizmu węgla, w tym glikolizie, glukoneogenezie i cyklu TCA – kluczowych węzłach metabolicznych dla wirulencji i żywotności C. albicans. Wyniki te podnoszą możliwość, że laktylacja uczestniczy w regulacji transkrypcyjnej i metabolicznej, zgodnie z ustaleniami w Trypanosoma brucei i ryżu. Pierwszy krok szlaku glikolitycznego jest katalizowany przez heksokinazę 2 (Hxk2) i glukokinazę 1 (Glk1). Laktylacja została wykryta na Hxk2 i Glk1, które, jak wiadomo, wpływają na adhezję, filamentację, wirulencję i patogeniczność C. albicans. Co godne uwagi, laktylacja Glk1 była obniżona w komórkach tolerancyjnych, sugerując potencjalną rolę w modulowaniu tolerancji na leki poprzez przepływ glikolityczny i własną ekspresję. Aldolaza fruktozo-1,6-bisfosforanu 1 (Fba1), inny istotny enzym glikolityczny implikowany w inwazyjność poprzez jego interakcję z plazminogenem, wykazywała 15 miejsc Kla, z czterema regulowanymi w dół i jednym regulowanym w górę w komórkach tolerancyjnych. Inne kluczowe enzymy glikolityczne, w tym enolaza 1 (Eno1) i kinaza pirogronianowa (Cdc19), wykazywały zmniejszone poziomy laktylacji w komórkach tolerancyjnych. Biorąc pod uwagę, że mutanty tych enzymów wykazują wrażliwość na leki i zmniejszoną wirulencję, regulacja w dół Kla może odzwierciedlać adaptacyjną przebudowę metaboliczną pod stresem flukonazolu. Podobnie, karboksykinaza fosfoenolopirogronianu 1 (Pck1) – kluczowy enzym glukoneogenezy – wykazywała 11 miejsc Kla, z zarówno poziomami laktylacji, jak i ekspresją białka wykazującymi tendencję spadkową w komórkach tolerancyjnych. Wcześniejsze badania wskazały, że szczepy mutantów pck1 wykazywały zmniejszoną wirulencję, ale pozostały zdolne do zarażania gospodarzy. W cyklu TCA, 276 miejsc Kla zidentyfikowano na 25 białkach, z dziewięcioma białkami wykazującymi zmniejszoną laktylację w komórkach tolerancyjnych. Laktylacja enzymów metabolicznych umożliwia komórkom odpowiadanie na zmiany środowiskowe poprzez szybkie wyczuwanie ich stanu energetycznego i elastyczne zmienianie szybkości lub kierunków. Zmniejszony centralny metabolizm węgla i centralny metabolizm energetyczny zostały zidentyfikowane jako najbardziej charakterystyczne cechy oporności. Ten szeroko rozpowszechniony spadek Kla w całym centralnym metabolizmie węgla może służyć jako mechanizm sprzężenia zwrotnego, aby ograniczyć metabolizm energetyczny pod stresem przeciwgrzybiczym. Regulacja w dół metabolizmu energetycznego i zdolności glikolitycznej wydaje się być znakiem rozpoznawczym tolerancji na flukonazol, pozwalając C. albicans przetrwać powoli w stanie niskiej energii, wystawionej na działanie leku.

Dalsze badania wyjaśnią mechanistyczne wkłady laktylacji do adaptacji patogenicznej C. albicans, tym samym pogłębiając nasze zrozumienie jej roli w oporności lub tolerancji na leki, identyfikując szlaki zależne od laktylacji jako potencjalne cele terapeutyczne dla przyszłych strategii przeciwgrzybiczych.

Jest to pierwsze badanie systematycznie delineujące laktyl-proteom ludzkiego patogenu C. albicans. Odkrycia te rozszerzają istniejące zrozumienie roli laktylacji w modyfikacji białek i wyjaśniają potencjalne funkcje tej nowatorskiej PTM w C. albicans. Znacząca modyfikacja Kla, obejmująca różnorodne procesy metaboliczne i regulacje biologiczne, podkreśla znaczenie laktylacji w modulowaniu fizjologii C. albicans. Ponadto, wyniki analizy różnicowej wykazały, że DLP są ściśle związane z procesami biosyntetycznymi i metabolicznymi C. albicans. Chociaż badanie to dostarcza interesującej perspektywy na temat związku między laktylacją a tolerancją na leki w C. albicans, niezbędna jest dodatkowa walidacja, aby w pełni zrozumieć rolę i wpływ laktylacji na tolerancję. Dlatego dalsze badania określą mechanizmy regulacyjne zapośredniczone przez laktylację leżące u podstaw tolerancji fenotypowej i patogeniczności w C. albicans, mające na celu zapewnienie innowacyjnych i silnych celów terapeutycznych dla opornych zakażeń Candida u pacjentów z obniżoną odpornością i dostarczenie wglądu w badania laktylomu innych patogenów.

Podsumowanie

Inwazyjne zakażenia Candida albicans stanowią istotny problem kliniczny z wysoką śmiertelnością wynoszącą od 40% do 70% u dorosłych. Mimo dostępności leków przeciwgrzybiczych, takich jak azole, polieny i echinokandyny, obserwuje się narastający problem tolerancji na leki, której mechanizmy pozostają słabo poznane. Badanie to jako pierwsze kompleksowo scharakteryzowało laktylom C. albicans, identyfikując ponad 10 tysięcy miejsc modyfikacji na prawie 2 tysiącach białek. Laktylacja lizyny okazała się modyfikacją potranslacyjną o kluczowym znaczeniu dla adaptacji metabolicznej patogenu, szczególnie w warunkach stresu lekowego. Analiza proteomiczna ujawniła, że laktylowane białka są szeroko zaangażowane w procesy translacji, metabolizm energetyczny oraz biosyntezę aminokwasów, z wyraźnym wzbogaceniem w białkach rybosomalnych i enzymach szlaków glikolitycznych. W komórkach tolerancyjnych na flukonazol zaobserwowano znacząco podwyższony ogólny poziom laktylacji w porównaniu z komórkami rodzicielskimi, podczas gdy w komórkach opornych różnica ta nie występowała. Szczególnie interesujące okazały się zmiany w modyfikacjach histonowych, gdzie zidentyfikowano 42 miejsca laktylacji, znacznie więcej niż u ludzi czy myszy. Wiele z tych miejsc wykazywało współwystępowanie z innymi modyfikacjami potranslacyjnymi, sugerując złożony crosstalk epigenetyczny. Kluczowe białka związane z wirulencją i odpowiedzią na stres, takie jak Hsp90, Ssa1 czy enzymy szlaku biosyntezy ergosterolu, również okazały się laktylowane. Analiza różnicowa wykazała, że w komórkach tolerancyjnych następuje charakterystyczna regulacja w dół laktylacji enzymów centralnego metabolizmu węgla, w tym glikolizy i cyklu TCA, co może odzwierciedlać adaptacyjną przebudowę metaboliczną umożliwiającą przetrwanie w stanie niskiej energii pod wpływem leku. Odkrycia te wskazują, że laktylacja stanowi istotny mechanizm epigenetyczny umożliwiający C. albicans szybką adaptację do stresu przeciwgrzybiczego poprzez modulację metabolizmu energetycznego i ekspresji genów. Badanie otwiera nowe perspektywy terapeutyczne, identyfikując szlaki zależne od laktylacji jako potencjalne cele dla przyszłych strategii przeciwgrzybiczych, szczególnie istotne w kontekście rosnącego problemu tolerancji i oporności na dostępne leki.