Nanosuspensja kurkuminy przełamuje oporność Candida na flukonazol

Czy nanosuspensja kurkuminy może przełamać oporność na flukonazol?

Nanosuspensja kurkuminy w połączeniu z flukonazolem redukuje wartości MIC nawet 32-krotnie u szczepów Candida albicans opornych na azole – wykazało badanie in vitro przeprowadzone na modelu biofilmu grzybiczego. Zespół naukowców opracował nanocząstki kurkuminy (CNS) o średnicy 147 nm i zbadał ich synergiczne działanie z FLC przeciwko czterem szczepom C. albicans, w tym jednemu klinicznie opornemu na flukonazol.

Candida albicans, komensalny grzyb obecny w mikrobiocie człowieka, stanowi poważne zagrożenie dla pacjentów z osłabioną odpornością – po transplantacji narządów, z AIDS czy poddawanych chemioterapii. Śmiertelność związana z zakażeniami układowymi sięga 40%. Szczególnie niepokojący jest fakt, że przewlekłe zakażenia C. albicans mogą mieć potencjał onkogenny – badania wykazały wyższe obciążenie grzybicze u pacjentów z rakiem jamy ustnej noszących protezy oraz podwyższone poziomy C. albicans u chorych z rakiem płaskonabłonkowym jamy ustnej.

Flukonazol pozostaje lekiem pierwszego rzutu w terapii kandydozy ze względu na korzystną biodostępność i bezpieczeństwo. Jednak długotrwałe stosowanie profilaktyczne FLC prowadzi do rozwoju oporności, a tworzenie biofilmów grzybiczych – zarówno na powierzchniach biologicznych, jak i sztucznych – stanowi dodatkową barierę fizyczną ograniczającą skuteczność większości leków przeciwgrzybiczych. Rosnąca populacja pacjentów z osłabioną odpornością na świecie oraz pojawiające się dowody onkogenności grzybów czynią opracowanie nowych strategii terapeutycznych pilnym priorytetem zdrowia publicznego.

Jak nanotechnologia poprawia właściwości farmaceutyczne kurkuminy?

Kurkumina, związek pochodzący z kurkumy, wykazuje szerokie spektrum aktywności biologicznych – działanie przeciwbakteryjne, przeciwwirusowe, przeciwgrzybicze i przeciwzapalne. Badania potwierdzają jej skuteczność przeciwko patogenom opornym na wiele leków, a także zdolność hamowania aktywności pomp wypływu C. albicans. Mimo obiecującego potencjału, zastosowanie kliniczne kurkuminy ograniczają słaba rozpuszczalność w wodzie, niska biodostępność, szybki metabolizm i niewystarczająca penetracja bariery krew-mózg.

Nanosuspensje – submikronowe zawiesiny koloidalne stabilizowane surfaktantami – oferują rozwiązanie tych problemów. Gdy cząstki leku są redukowane do rozmiarów poniżej 1 μm, ich powierzchnia i rozpuszczalność nasycenia znacząco rosną, co prowadzi do poprawy kinetyki rozpuszczania. Współczesne techniki farmaceutyczne umożliwiają produkcję jednolitych i stabilnych nanosuspensji kurkuminy, które zwiększają jej rozpuszczalność w wodzie ponad 40-krotnie i osiągają całkowite rozpuszczenie in vitro w ciągu 60 minut.

W badanym preparacie CNS cząstki kurkuminy miały średni rozmiar 147,0 ± 1,3 nm, wskaźnik polidyspersji (PDI) wynosił 0,079 ± 0,013, a potencjał zeta –28,8 ± 0,251 mV. Mikroskopia elektronowa ujawniła, że surowe cząstki kurkuminy były nieregularne, przypominające pręty i wielkości mikrometrycznej, podczas gdy cząstki CNS były sferyczne, równomiernie rozmieszczone, bez agregacji i o gładkiej powierzchni. Ocena stabilności wykazała, że CNS pozostawała stabilna w ciągu pierwszych 12 godzin, po czym rozmiar cząstek stopniowo wzrastał, osiągając około 200 nm po 24 godzinach.

Jaką skuteczność wykazuje połączenie CNS i flukonazolu?

Badanie obejmowało cztery szczepy C. albicans: jeden szczep referencyjny ATCC90028 oraz trzy szczepy kliniczne (CCA1, CCA2, CCA3), z których CCA3 był potwierdzony jako oporny na flukonazol. Model biofilmu charakteryzowano przez 48 godzin, obserwując progresję od form drożdżowych (2 h) przez rurki kiełkujące i pseudostrzępki (6–12 h) do rozległego wydłużenia strzępek i proliferacji (24 h), aż do dojrzałych biofilmów złożonych z gęstej sieci komórek drożdżowych, strzępek i macierzy pozakomórkowej (48 h).

CNS sama wykazywała niewielką aktywność przeciwgrzybiczą wobec komórek planktonowych C. albicans (MIC >256 μg/mL). Jednak połączenie CNS i FLC znacząco obniżyło wartości MIC wobec komórek planktonowych, z wartościami wskaźnika frakcyjnego stężenia hamującego (FICI) w zakresie 0,25–0,5, co wskazuje na silny efekt synergiczny. Dla szczepu ATCC90028 MIC FLC spadło z 2 μg/mL do 0,5 μg/mL, przy jednoczesnym zastosowaniu CNS 32 μg/mL (FICI: 0,38). W przypadku opornego szczepu CCA3, MIC FLC zmniejszyło się z 512 μg/mL do zaledwie 2 μg/mL w obecności CNS 128 μg/mL (FICI: 0,25).

Połączone działanie CNS i FLC oceniano również wobec biofilmów czterech szczepów C. albicans. CNS obniżyła siedzące MIC (SMIC₅₀) FLC z 1024 μg/mL do 32–128 μg/mL, z wartościami FICI między 0,25 a 0,38, wykazując spójną synergię we wszystkich testowanych szczepach. Dla szczepu ATCC90028 SMIC₅₀ FLC spadło z 256 μg/mL do 32 μg/mL w obecności CNS 64 μg/mL (FICI: 0,25). Dla opornego szczepu CCA3, SMIC₅₀ FLC zmniejszyło się z 1024 μg/mL do 128 μg/mL przy CNS 256 μg/mL (FICI: 0,38).

Test redukcji XTT wykazał, że leczenie skojarzone znacząco zmniejszyło aktywność metaboliczną w porównaniu zarówno z kontrolą, jak i grupami otrzymującymi pojedyncze leki (p <0,05). Dodatkowo kwantyfikacja biomasy metodą suchej wagi wykazała, że grupa otrzymująca kombinację wykazywała wyraźną redukcję masy biofilmu w stosunku do wszystkich innych grup (p <0,05), demonstrując skuteczne hamowanie tworzenia biofilmu przez CNS i FLC.

W jaki sposób CNS przełamuje mechanizmy oporności?

Oporność C. albicans na leki azolowe, takie jak FLC, jest często związana ze wzmożoną aktywnością pomp wypływu. Kurkumina hamuje pompy wypływu w C. albicans głównie poprzez obniżenie ekspresji transporterów ABC, takich jak CDR1, poprzez posttransskrypcyjne zakłócenie Hsp90, a także bezpośrednio konkuruje z substratami takimi jak rodamina 6G (Rh6G), blokując aktywność wypływu.

W badaniu zastosowano Rh6G jako fluorescencyjny surogat FLC do monitorowania aktywności transportu. Na podstawie wstępnych eksperymentów wybrano stężenie 128 μg/mL CNS ze względu na jego znaczące obniżenie MIC FLC wobec opornego szczepu CCA3. Wewnątrzkomórkowa intensywność fluorescencji była znacząco wyższa w grupie leczonej CNS w porównaniu z kontrolą (p <0,05), sugerując, że CNS zwiększa akumulację Rh6G wewnątrz komórek. Wyniki te wskazują, że synergiczny efekt przeciwgrzybiczny CNS i FLC jest związany z modulacją mechanizmów wychwytu i wypływu leków w opornym C. albicans.

Geny z rodziny agglutinin-like sequence (ALS) odgrywają kluczową rolę w patogenności C. albicans. ALS1 koduje adhezyny pośredniczące w wiązaniu z komórkami śródbłonka i nabłonka podczas tworzenia biofilmu, podczas gdy ALS3 promuje rozwój strzępek i adhezję komórkową. HWP1 ułatwia przyleganie grzybów do komórek gospodarza i wzmacnia integralność biofilmu, a EFG1 reguluje morfogenezę, tworzenie strzępek i wirulencję.

Ekspresję genów związanych z adhezją i tworzeniem biofilmu (ALS1, ALS3, HWP1, EFG1) oceniono za pomocą qRT-PCR. Wszystkie geny docelowe wykazywały obniżoną ekspresję po leczeniu lekami. Podczas gdy CNS lub FLC samodzielnie powodowały niewielkie redukcje ekspresji w porównaniu z kontrolą, kombinacja CNS i FLC skutkowała znaczącym obniżeniem ekspresji (p <0,01 do p <0,001). Dla szczepu ATCC90028 ekspresja ALS1 spadła o ~60%, ALS3 o ~70%, HWP1 o ~65%, a EFG1 o ~55% w grupie otrzymującej leczenie skojarzone. Dla opornego szczepu CCA3 zaobserwowano podobne wzorce – ekspresja ALS1 zmniejszyła się o ~55%, ALS3 o ~65%, HWP1 o ~70%, a EFG1 o ~50%.

Jak wygląda biofilm po leczeniu skojarzonym?

Obrazowanie SEM biofilmów C. albicans ATCC90028 ujawniło wyraźne różnice morfologiczne między grupami. Grupa kontrolna wykazywała dojrzałe biofilmy z gęstymi sieciami strzępkowymi. Leczenie samą CNS lub FLC zmniejszyło gęstość strzępek i zakłóciło integralność biofilmu. W przeciwieństwie do tego, grupa otrzymująca kombinację niemal całkowicie zniosła wzrost strzępek i tworzenie biofilmu, z widocznymi jedynie rozproszonymi komórkami.

Obserwacje mikroskopii odwróconej korelowały dobrze z wynikami SEM. Podczas gdy biofilmy kontrolne wykazywały gęste, ustrukturyzowane maty strzępkowe, leczenie pojedynczymi lekami skutkowało cieńszymi, jednowarstwowymi strukturami. Grupa otrzymująca leczenie skojarzone wykazywała jedynie izolowane komórki bez zorganizowanego biofilmu.

Obrazowanie konfokalne laserowe skaningowe (CLSM) z użyciem barwienia SYTO9 i jodkiem propidyny dodatkowo potwierdziło zwiększoną skuteczność leczenia skojarzonego. Biofilmy kontrolne wykazywały intensywną zieloną fluorescencję (komórki żywe), z minimalnym sygnałem czerwonym. Pojedyncze leczenia umiarkowanie zmniejszyły żywotność, podczas gdy grupa otrzymująca kombinację przedstawiała wyraźnie zmniejszoną zieloną fluorescencję i zwiększone barwienie czerwone, wskazując na rozległą śmierć komórek. Rekonstrukcja 3D biofilmów potwierdziła te odkrycia – grupa otrzymująca leczenie skojarzone wykazywała poważnie zakłóconą topografię biofilmu w porównaniu z ustrukturyzowanymi architekturami widocznymi w grupach kontrolnych i otrzymujących pojedyncze leczenie.

“Nasze wyniki sugerują, że połączenie CNS i FLC może znacząco poprawić wyniki terapii poprzez wielokierunkowe mechanizmy działania” – piszą autorzy badania, podkreślając potencjał kliniczny tej strategii.

Jakie są perspektywy klinicznego zastosowania?

Wyniki badania otwierają nowe możliwości terapeutyczne dla pacjentów z opornymi zakażeniami C. albicans, szczególnie w populacji z osłabioną odpornością. Redukcja MIC FLC nawet 256-krotnie w obecności CNS (z 512 μg/mL do 2 μg/mL dla szczepu CCA3) sugeruje, że kombinacja może przywrócić skuteczność flukonazolu wobec szczepów pierwotnie opornych. Wartości FICI poniżej 0,5 potwierdzają silną synergię farmakologiczną, co jest kluczowe w kontekście ograniczonej liczby dostępnych leków przeciwgrzybiczych.

Szczególnie obiecujące wydaje się zastosowanie tej strategii w kandydozie jamy ustnej u pacjentów z HIV/AIDS, po chemioterapii czy u biorców przeszczepów narządów – grup, w których kolonizacja jamy ustnej przez C. albicans często progresuje do kandydozy śluzówkowej, a następnie może prowadzić do zakażeń układowych. Nanosuspensja kurkuminy, ze względu na poprawioną biodostępność i możliwość aplikacji miejscowej, mogłaby stanowić alternatywę dla systemowego leczenia azolami w przypadkach oporności lub przeciwwskazań do terapii systemowej.

Kluczowym wyzwaniem pozostaje jednak stabilność preparatu – CNS wykazywała stabilność przez 12 godzin, po czym rozmiar cząstek wzrastał. To ograniczenie wymaga dalszych prac nad optymalizacją formulacji, aby zapewnić odpowiednią trwałość produktu farmaceutycznego. Dodatkowo, chociaż badania in vitro są obiecujące, brakuje danych dotyczących farmakokinetyki, biodystrybucji i bezpieczeństwa CNS w warunkach in vivo.

Autorzy badania podkreślają, że precyzyjne mechanizmy molekularne – szczególnie regulacja transporterów grzybiczych i związanych szlaków sygnałowych – wymagają dalszych badań. Kompleksowe oceny biokompatybilności z użyciem testów komórkowych in vitro i modeli zwierzęcych in vivo są niezbędne do weryfikacji bezpieczeństwa i potencjału terapeutycznego CNS przed translacją kliniczną.

Co to oznacza dla praktyki klinicznej?

Nanosuspensja kurkuminy w połączeniu z flukonazolem wykazuje silne działanie synergiczne przeciwko szczepom Candida albicans opornym na azole, redukując wartości MIC i SMIC₅₀ nawet 32-krotnie. Mechanizm działania obejmuje hamowanie pomp wypływu, obniżenie ekspresji kluczowych genów adhezyjnych (ALS1, ALS3, HWP1, EFG1) oraz destrukcję integralności biofilmu. Obrazowanie mikroskopowe potwierdza niemal całkowite zniesienie wzrostu strzępek i tworzenia biofilmu w grupie otrzymującej leczenie skojarzone.

Badanie dostarcza solidnych dowodów na potencjał terapeutyczny nanotechnologii w przełamywaniu oporności przeciwgrzybiczej. Szczególnie istotne jest to dla pacjentów z osłabioną odpornością, u których zakażenia kandydozowe stanowią poważne zagrożenie życia. Zastosowanie naturalnych związków pochodzących z medycyny tradycyjnej chińskiej w postaci nanocząstek otwiera nową drogę w walce z patogenami opornymi na wiele leków.

Kluczowe ograniczenia to wyłącznie model in vitro oraz ograniczona stabilność preparatu CNS (12 godzin). Przed wprowadzeniem do praktyki klinicznej niezbędne są badania farmakokinetyczne, toksykologiczne oraz próby kliniczne oceniające skuteczność i bezpieczeństwo u ludzi. Niemniej jednak, wyniki te stanowią ważny krok w kierunku opracowania nowych strategii terapeutycznych dla trudnych do leczenia zakażeń grzybiczych.