Nowy mechanizm oporności C. parapsilosis na azole – przełomowe odkrycie

Czy globalna epidemiologia kandydozy zagraża pacjentom?

Kandydoza stanowi czwartą najczęstszą przyczynę sepsy związanej z opieką zdrowotną, powodując około 1 565 000 zakażeń krwi i 995 000 zgonów rocznie na całym świecie. W ostatnich latach obserwuje się niepokojący wzrost liczby zakażeń wywoływanych przez gatunki non-albicans, wśród których szczególne znaczenie ma Candida parapsilosis. Ten oportunistyczny patogen odpowiada za ogniska zakażeń w Europie, Azji, Afryce Południowej i Ameryce Łacińskiej, charakteryzując się wysokim odsetkiem nabytej oporności na azole.

Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) umieściła C. parapsilosis na liście priorytetowych patogenów grzybiczych, aby zwiększyć świadomość kliniczną dotyczącą tego drobnoustroju i wdrożyć odpowiednie programy kontroli zakażeń oraz racjonalnej antybiotykoterapii. “Identyfikacja nowych mechanizmów oporności jest kluczowa dla skutecznego przeciwdziałania rozprzestrzenianiu się patogenów opornych na leki przeciwgrzybicze” – podkreślają autorzy prezentowanego badania.

Włochy stały się centrum kilku ognisk klinicznych C. parapsilosis opornych na azole, w tym obecnie trwającego w Azienda Ospedaliero-Universitaria Pisana, gdzie C. parapsilosis stała się najczęściej izolowanym gatunkiem wśród wszystkich drożdżaków wyizolowanych z zakażeń krwi. Co więcej, aż 62,7% izolatów wykazuje oporność na flukonazol, a 52,9% na worykonazol. Badanie epidemiologiczne przeprowadzone w tym ośrodku wykazało, że ognisko kliniczne rozpoczęło się w 2018 roku, osiągając szczyt w 2021 roku pod względem częstości występowania i wskaźników oporności na leki przeciwgrzybicze.

Jakie mechanizmy oporności ujawniają badania genetyczne?

Genetyczne determinanty oporności na azole u Candida spp. obejmują mutacje typu gain- lub loss-of-function w genach czynników transkrypcyjnych kodujących pompy efflux lub komponenty biosyntezy ergosterolu, a także mutacje w genach ERG zaangażowanych w syntezę ergosterolu. W przypadku C. parapsilosis najczęściej spotykanym mechanizmem oporności na związki azolowe jest obecność mutacji A395T prowadzącej do podstawienia aminokwasowego Y132F, a następnie podstawienia aminokwasowe R398I i G458S w genie CpERG11, a także mutacje w genie CpMRR1, kodującym czynnik transkrypcyjny regulujący ekspresję pompy efflux MDR1.

Włoscy naukowcy zidentyfikowali nowy mechanizm oporności na azole u C. parapsilosis związany z mutacją C2585G w genie CpMRR1, prowadzącą do substytucji aminokwasowej S862C w czynniku transkrypcyjnym. Celem badania była ocena wpływu tej mutacji na rozwój oporności na azole przy użyciu strategii edycji genomu opartej na technologii CRISPR/Cas9.

W badaniu wykorzystano 16 izolatów klinicznych C. parapsilosis pobranych z różnych oddziałów szpitalnych, głównie z oddziałów intensywnej terapii. Identyfikację izolatów przeprowadzono metodą MALDI-TOF, a testy wrażliwości na leki przeciwgrzybicze wykonano metodą mikrorozcieńczeń w bulionie zgodnie z zaleceniami EUCAST. Sekwencjonowanie całego genomu przeprowadzono na platformie Illumina NextSeq 500, skupiając się na analizie genów CpMRR1 i CpERG11, związanych odpowiednio z regulacją ekspresji pompy efflux i syntezą ergosterolu.

Co istotne, wszystkie oporne klinicznie izolaty C. parapsilosis posiadały mutację C2585G w genie CpMRR1 w heterozygocie, a także znaną mutację A395T w genie CpERG11, prowadzącą do substytucji Y132F. Aby ocenić bezpośredni wpływ mutacji C2585G na oporność na azole, badacze zastosowali system edycji genomu CRISPR-Cas9 do wprowadzenia tej mutacji do wrażliwych na azole szczepów referencyjnych.

Badacze zaprojektowali 20-nukleotydową sekwencję RNA przewodnika (gRNA) przy użyciu oprogramowania EuPaGDT, która była przyległa do motywu PAM 5′-NGG-3′ w regionie genu CpMRR1, gdzie znaleziono interesującą mutację (C2585G). Wykorzystano również matrycę naprawczą DNA (RT-DNA) zawierającą substytucję C2585G. Transformację przeprowadzono metodą elektroporacji, a oporne na nourseotrycynę klony poddano dalszej analizie.

Rezultaty były jednoznaczne – uzyskane mutanty wykazywały zwiększoną oporność na flukonazol i worykonazol. Klony pozyskane z wrażliwego szczepu referencyjnego C. parapsilosis ATCC 22019 oraz izolatów klinicznych CpM i CpL wykazywały znacznie podwyższone wartości MIC dla flukonazolu (od 8 do 128 mg/L) w porównaniu z ich szczepami rodzicielskimi (MIC = 1 mg/L). “Nasze wyniki pokazują, że mutacja C2585G w genie CpMRR1 prowadzi do rozwoju oporności na azole u C. parapsilosis, co potwierdziliśmy zarówno na poziomie fenotypowym, jak i molekularnym” – piszą autorzy badania.

Mutacja C2585G powoduje nadekspresję nie tylko samego genu CpMRR1, ale także genów CpMDR1B i CpCDR1B, kodujących białka transportowe odpowiedzialne za usuwanie leków z komórki. Interesująco, klony homozygotyczne wykazywały wyższy poziom ekspresji tych genów i wyższe wartości MIC dla azoli w porównaniu z klonami heterozygotycznymi, ale jednocześnie charakteryzowały się wolniejszym tempem wzrostu.

Analiza krzywych wzrostu wykazała, że zarówno klony heterozygotyczne (CpALPHA-4, CpM-19) wykazywały podobne tempo wzrostu do szczepów rodzicielskich (ATCC 22019, CpM), podczas gdy tempo wzrostu klonów homozygotycznych było znacząco wolniejsze w porównaniu z ich odpowiednimi szczepami dzikimi (p < 0,05). Wskazuje to na pewien koszt biologiczny związany z homozygotyczną mutacją C2585G.

Analiza bioinformatyczna z wykorzystaniem narzędzia SIFT wykazała, że substytucja S862C ma szkodliwy wpływ na funkcjonalność białka CpMrr1. Wizualizacja efektu mutacji na strukturę aminokwasową białka ujawniła znaczące zmiany w interakcjach między aminokwasami w obrębie struktury białka.

Jak podkreślają autorzy, mutacja S862C występuje w domenie C-końcowej czynnika transkrypcyjnego CpMrr1. Chociaż dokładna struktura i funkcja różnych domen CpMrr1 w C. parapsilosis nie zostały jeszcze w pełni zbadane, badania przeprowadzone na analogicznych białkach u innych gatunków, takich jak Candida albicans i Saccharomyces cerevisiae, sugerują, że mutacje w domenie C-końcowej mogą zapobiegać inhibicji czynnika transkrypcyjnego przez domenę autoregulacyjną.

Co istotne, nowa mutacja opisana w tym badaniu grupuje się z innymi wcześniej opisanymi wariantami aminokwasowymi w CpMrr1, takimi jak podstawienie A854V badane przez Doorley i współpracowników. Takie mutacje występujące jako homozygoty w tej samej domenie białkowej były wcześniej powiązane z rozwojem oporności na azole.

Badanie wykazało również, że strategia edycji pojedynczych zasad CRISPR-Cas9 jest wiarygodnym narzędziem zdolnym do indukowania punktowych mutacji w genie CpMRR1 wrażliwych na azole szczepów C. parapsilosis. Analiza ekspresji genów wykazała wzrost poziomów mRNA genu CpMRR1 oraz genów CpMDR1B i CpCDR1B regulowanych przez CpMrr1 we wszystkich klonach mutantów, z większymi zmianami u tych posiadających genotyp homozygotyczny.

Jakie implikacje kliniczne wynikają z badań nad opornością?

Odkrycie to ma istotne implikacje kliniczne. Czy wprowadzenie badań molekularnych wykrywających mutację C2585G do rutynowej diagnostyki może przyczynić się do wcześniejszego wykrywania opornych szczepów? “Identyfikacja nowo opisanego mechanizmu oporności w procedurach przesiewowych izolatów klinicznych z pewnością prowadziłaby do wczesnego wykrycia nowych opornych szczepów, umożliwiając procedury izolacji i dezynfekcji, zapobiegając tym samym wczesnemu rozprzestrzenianiu się takich opornych szczepów w szpitalu” – twierdzą badacze.

Oporne na azole szczepy C. parapsilosis mogą rozprzestrzeniać się poprzez kontakt rąk od jednego pacjenta do drugiego, a przeżycie tego drożdżaka w organizmie gospodarza może być przedłużone, niezależnie od ekspozycji na związki azolowe, ponieważ koszty biologiczne szczepów opornych na azole są podobne do szczepów wrażliwych. Te aspekty, wraz z nadmiernym stosowaniem leków przeciwgrzybiczych, są kluczowe w ogniskach klinicznych.

W kontekście, w którym inwazyjne zakażenia wywołane przez oporne na leki szczepy są coraz częstsze, dostępność metod molekularnych do wykrywania mutacji związanych z opornością na azole może pomóc klinicystom zaoszczędzić czas przy wyborze odpowiedniego leku do leczenia formy inwazyjnej, a także przewidywać oporny fenotyp. Mogłoby to stanowić solidną strategię nadzoru nad opornością w kontekście programów zarządzania lekami przeciwgrzybiczymi, prowadząc do odpowiedniego stosowania echinokandyn, gdy są rzeczywiście potrzebne, zapobiegając tym samym ich nadużywaniu i potencjalnemu rozwojowi tolerancji i dalszej oporności.

Badanie to identyfikuje i demonstruje po raz pierwszy udział mutacji C2585G i substytucji aminokwasowej S862C w czynniku transkrypcyjnym CpMrr1 w rozwoju oporności na azole zarówno w referencyjnych, jak i klinicznych szczepach C. parapsilosis. Wyniki mogą być korzystne w praktyce klinicznej z perspektywy kontroli zakażeń. Wprowadzenie nowo opisanego mechanizmu oporności do procedur przesiewowych izolatów klinicznych z pewnością prowadziłoby do wczesnego wykrycia nowych opornych szczepów, umożliwiając procedury izolacji i dezynfekcji, zapobiegając tym samym wczesnemu rozprzestrzenianiu się takich opornych szczepów w szpitalu.

Wyniki tego badania mogą mieć znaczący wpływ na praktykę kliniczną w perspektywie kontroli zakażeń. Wprowadzenie badań genetycznych i molekularnych do rutynowej diagnostyki może poprawić wybór terapii przeciwgrzybiczych oraz zapobiegać rozprzestrzenianiu się opornych szczepów w szpitalach. Ponadto, zrozumienie mechanizmów oporności na poziomie molekularnym może prowadzić do opracowania nowych strategii terapeutycznych skierowanych przeciwko opornym szczepom C. parapsilosis.

W kontekście rosnącego problemu oporności na leki przeciwgrzybicze, identyfikacja nowych mechanizmów oporności ma kluczowe znaczenie dla skutecznego przeciwdziałania rozprzestrzenianiu się patogenów opornych. Badanie to stanowi ważny krok w tym kierunku, dostarczając cennych informacji na temat mechanizmów oporności na azole u C. parapsilosis.

Czy odkrycie to zmieni podejście do diagnostyki i leczenia zakażeń wywoływanych przez C. parapsilosis? Jakie inne mechanizmy oporności mogą występować u tego patogenu? Pytania te wymagają dalszych badań, ale już teraz wyniki tego badania mogą pomóc w opracowaniu bardziej skutecznych strategii zapobiegania i leczenia zakażeń wywoływanych przez oporne szczepy C. parapsilosis.

Podsumowanie

Badanie koncentruje się na odkryciu nowego mechanizmu oporności na azole u Candida parapsilosis, który jest czwartym najczęstszym patogenem wywołującym sepsę związaną z opieką zdrowotną. Naukowcy zidentyfikowali mutację C2585G w genie CpMRR1, prowadzącą do substytucji aminokwasowej S862C w czynniku transkrypcyjnym. Wykorzystując technologię CRISPR/Cas9, potwierdzili, że mutacja ta bezpośrednio przyczynia się do rozwoju oporności na azole, powodując nadekspresję genów odpowiedzialnych za usuwanie leków z komórki. Badania wykazały, że szczepy z mutacją homozygotyczną wykazują wyższy poziom oporności, ale wolniejsze tempo wzrostu w porównaniu ze szczepami heterozygotycznymi. Odkrycie to ma istotne znaczenie kliniczne, gdyż wprowadzenie badań molekularnych wykrywających tę mutację do rutynowej diagnostyki może umożliwić wcześniejsze wykrywanie opornych szczepów i skuteczniejsze zapobieganie ich rozprzestrzenianiu się w środowisku szpitalnym.