Peptyd hLF(1-11) – nowa nadzieja w walce z opornymi infekcjami grzybiczymi

Czy infekcje grzybicze stanowią rosnące wyzwanie?

Inwazyjne infekcje grzybicze (IFI) stanowią coraz poważniejszy problem zdrowotny, charakteryzujący się trudną i późną diagnostyką oraz wysoką śmiertelnością, dotykając rosnącą liczbę pacjentów z obniżoną odpornością. Ze względu na ich znaczenie dla zdrowia publicznego, wiele z tych patogenów znalazło się na liście WHO patogenów grzybiczych. Candida albicans, oportunistyczny drożdżak powodujący infekcje śluzówkowe lub inwazyjne u pacjentów z osłabionym układem immunologicznym, pozostaje dominującym gatunkiem odpowiedzialnym za kandydozę. Jednak najnowsze badania kliniczne wskazują na rosnącą częstość kandydemii powodowanej przez gatunki non-albicans, takie jak C. parapsilosis, C. tropicalis, Nakaseomyces glabratus (znany również jako C. glabrata), Pichia kudriavzevii (znana jako C. krusei) oraz, w ostatnich latach, Candidozyma auris (znana jako C. auris).

Oporność na powszechnie stosowane leki przeciwgrzybicze jest dobrze znanym zjawiskiem, zarówno nabyta – jak w przypadku C. albicans stającej się oporną na azole, jak i wrodzona – np. N. glabratus wykazujący słabą wrażliwość na azole i echinokandyny. Przedłużone leczenie i profilaktyczne stosowanie leków znacząco zwiększają prawdopodobieństwo rozwoju oporności różnych gatunków Candida. Obecnie arsenał leków przeciwgrzybiczych do leczenia infekcji systemowych ogranicza się do pięciu klas: polienów (amfoterycyna B), triazoli (np. itrakonazol i flukonazol), echinokandyn (np. kaspofungina, mikafungina i anidulafungina), flucytozyny i allylaminy. W obliczu rosnącej częstości występowania oporności na leki, istnieje pilna potrzeba opracowania nowych środków przeciwgrzybiczych.

Candidozyma auris została opisana po raz pierwszy w 2009 roku na podstawie pojedynczego izolatu z zewnętrznego kanału słuchowego pacjenta w Japonii i od tego czasu rozprzestrzeniła się na całym świecie. W USA zgłoszono ponad 10 000 infekcji C. auris w latach 2016-2023, a u 22 931 osób stwierdzono kolonizację bez objawów. Cz. auris wykryto w 61 krajach na sześciu kontynentach, ze znaczącymi ogniskami w określonych środowiskach opieki zdrowotnej w RPA i Indiach, gdzie patogen ten jest powiązany z nawet 25% i 40% przypadków kandydemii.

Rzeczywiste liczby mogą być znacznie wyższe ze względu na niski wskaźnik identyfikacji. Cz. auris głównie kolonizuje ludzi bez wywoływania objawów, ale infekcja tym drożdżakiem może prowadzić do różnych problemów zdrowotnych, w tym zakażeń ucha, ran, dróg moczowych, a przede wszystkim zakażeń krwi. Infekcje Cz. auris są związane z kilkoma czynnikami ryzyka, takimi jak długotrwała hospitalizacja, zabiegi transplantacyjne, procedury inwazyjne i choroby podstawowe, takie jak cukrzyca lub zakażenie HIV. W konsekwencji pacjenci OIT są najbardziej zagrożeni. Śmiertelność związana z infekcją Cz. auris waha się między 30% a 72%, w zależności od chorób współistniejących pacjentów.

Leczenie infekcji Cz. auris jest wyzwaniem. Infekcje objawowe są leczone najchętniej echinokandynami, takimi jak kaspofungina, ze względu na stosunkowo łagodne skutki uboczne. Oporność Cz. auris na powszechnie stosowane leki przeciwgrzybicze jest spowodowana różnymi czynnikami, takimi jak mutacje w genie ERG11 (zwiększona liczba kopii genu ERG11), nadekspresja pomp efflux, takich jak CDR1 i MDR1, oraz nadmierne i profilaktyczne stosowanie środków przeciwgrzybiczych. Prawie wszystkie izolaty Cz. auris są oporne na flukonazol. Rosnącym problemem jest rozwój oporności na leki; Cz. auris jest znana z wrodzonej oporności na szeroki zakres środków przeciwgrzybiczych, obejmujących azole, echinokandyny i polieny, co czyni ją trudnym patogenem do zwalczania. Niektóre izolaty Cz. auris są nawet oporne na wszystkie trzy klasy antybiotyków przeciwgrzybiczych.

Czy peptyd hLF(1-11) rewolucjonizuje terapię grzybiczą?

W tym kontekście peptydy przeciwdrobnoustrojowe (AMP) mogą stanowić alternatywę dla powszechnie stosowanych schematów leczenia przeciwgrzybiczego infekcji wywołanych przez Cz. auris. Laktoferryna (LF) to peptyd o masie 80 kDa, występujący m.in. w mleku i ślinie zwierząt, w tym ludzi. Ludzka LF (hLF) wykazuje działanie bakteriobójcze wobec wielu patogenów i sugeruje się, że jest aktywna przeciwko biofilmom. W omawianym badaniu wykorzystano syntetyczny peptyd pochodzący z ludzkiej laktoferryny hLF(1-11) (sekwencja: GRRRRSVQWCA), który wcześniej wykazał szerokie spektrum przeciwdrobnoustrojowe. “Mechanizm przeciwgrzybiczny peptydu hLF1-11 obejmuje zakłócanie błon komórkowych grzybów i celowanie w funkcje mitochondrialne, prowadząc do śmierci komórki. Wchodzi on w interakcje z komórkami odpornościowymi i wzmacnia ich funkcję, sprzyjając bardziej energicznej odpowiedzi przeciwgrzybiczej” – wyjaśniają autorzy badania.

Celem badania było zbadanie wrażliwości różnych, klinicznie istotnych gatunków Candida i gatunków, które do niedawna były klasyfikowane w rodzaju Candida, w tym Cz. auris, na hLF(1-11) in vitro oraz zbadanie interakcji tego peptydu z dwoma powszechnie stosowanymi środkami przeciwgrzybiczymi: flukonazolem i anidulafunginą.

Badanie przeprowadzono w celu określenia wrażliwości kilku klinicznie istotnych gatunków drożdży należących do rodzaju Candida lub do niedawna sklasyfikowanych w tym rodzaju na hLF(1-11). Nacisk położono na Cz. auris. Oceniono 59 szczepów należących do 16 różnych gatunków drożdży. hLF(1-11) był skuteczny przeciwko wszystkim 59 badanym szczepom, z wartościami MIC (minimalne stężenie hamujące) wahającymi się od średnio 25 μg/ml (6,25 μg/ml do 50 μg/ml) w jednym lub dwóch etapach miareczkowania, i wszystkie uznano za wrażliwe. Kontrole negatywne, które inkubowano wyłącznie z komórkami lub inkubowano z c-LF(1-11), dały znacznie wyższe MIC >100 μg/ml i nie wykazały oznak zahamowania wzrostu.

Różne szczepy Cz. auris wykazały wartości MIC 12,5 lub 25 μg/ml dla hLF(1-11). Zakres wartości MIC szczepów należących do wszystkich badanych gatunków dla flukonazolu (FLU) i anidulafunginy (ANI) wynosił odpowiednio od 0,25 do 128 μg/ml i od 0,025 do 8 μg/ml. W testach kombinacyjnych hLF(1-11) z FLU lub ANI wartości MIC zarówno dla peptydu, jak i środków przeciwgrzybiczych były niższe niż gdy związki testowano osobno. Najniższa wartość MIC z testów kombinacyjnych była o dwa rozcieńczenia niższa (1,56 μg/ml w porównaniu do 6,25 μg/ml), a najwyższa o jedno rozcieńczenie niższa (25 μg/ml w porównaniu do 50 μg/ml) niż gdy hLF(1-11) testowano samodzielnie.

W badaniach synergii przetestowano 17 szczepów szesnastu gatunków. Dla FLU efekt synergistyczny ([FIC] ≤ 0,5) był obecny dla jednego szczepu D. rugosa CBS7138, a dla ANI dla dwóch szczepów Cz. auris CBS15279 i N. nivariensis CBS 9983. Efekt addytywny ([FIC] = 0,5-1) dla FLU zaobserwowano dla 15 szczepów należących do 14 gatunków, a dla ANI dla 13 szczepów 12 gatunków. Pośrednie wartości [FIC] ([FIC] = 1-2), które ujawniają efekt obojętny, zaobserwowano dla testów FLU wobec dwóch szczepów C. dubliniensis CBS 7987 i Cz. haemuli CBS 180 oraz dla ANI, trzech szczepów: C. parapsilosis CBS604, Cyberlindnera jadinii CBS 1600 i Nakaseomyces bracarensis CBS 10154. Nie zaobserwowano efektu antagonistycznego ([FIC] ≥ 2).

Głównym celem badawczym w tym badaniu była ocena wrażliwości drożdży należących do rodzaju Candida lub gatunków wcześniej sklasyfikowanych w tym rodzaju, ze szczególnym uwzględnieniem Cz. auris. Zgodnie z wcześniejszymi badaniami, stwierdzono silny efekt przeciwdrobnoustrojowy hLF(1-11) we wszystkich szczepach wszystkich badanych gatunków drożdży. Ponadto wszystkie wartości dla grupy Cz. auris wynosiły 12,5 μg/ml lub 25 μg/ml i uznano je za wrażliwe. Peptyd hLF(1-11) znacząco hamował wzrost Cz. auris w porównaniu z negatywnym peptydem kontrolnym.

Jak peptydy przeciwdrobnoustrojowe pokonują oporność?

Nie zaobserwowano korelacji między wrażliwością na hLF(1-11) a geograficznym pochodzeniem szczepów Cz. auris, ale należy podkreślić, że nie uwzględniono w tym badaniu całej znanej różnorodności genetycznej i geograficznej. W przeciwieństwie do silnej oporności Cz. auris na obecnie stosowane środki przeciwgrzybicze, żaden z szczepów Cz. auris nie wykazał oporności na hLF(1-11). Ten pozorny brak oporności na hLF(1-11) można wytłumaczyć faktem, że hLF(1-11) ma inne mechanizmy działania niż powszechnie stosowane środki przeciwgrzybicze.

LF jest kationowym, zasadowym i amfipatycznym peptydem, który indukuje napływ Ca²⁺ do mitochondriów, prowadząc do uwolnienia produkcji adenozynotrifosforanu (ATP) i reaktywnych form tlenu (ROS). “Azole, echinokandyny i polieny są nienaładowanymi cząsteczkami oddziałującymi ze ścianą komórkową i błonami komórkowymi; po drugie, drożdżak nie rozwinął mechanizmów oporności, prawdopodobnie dlatego, że peptyd nie jest jeszcze powszechnie stosowany” – zauważają badacze. Można argumentować, że jest mniej prawdopodobne, aby się rozwinęła, ponieważ LF jest obecna w mleku matki i ślinie, gdzie współistnieje przez dłuższy czas z patogenami, w tym drożdżami. Chociaż badanie to nie wykazało oporności na hLF(1-11), literatura sugeruje, że nie można całkowicie wykluczyć długoterminowego rozwoju oporności na LF, ale potrzebne są badania długoterminowej ekspozycji, aby to dalej zbadać.

Peptydy przeciwdrobnoustrojowe są idealnymi kandydatami na nowe terapie przeciwgrzybicze, ponieważ ich toksyczność jest minimalna lub nieobecna, wskaźniki rozwoju oporności są niskie, a mogą być stosowane z lekiem przeciwgrzybiczym. W badaniu wykazano, że syntetyczny przeciwdrobnoustrojowy peptyd uszkadzający błony i immunomodulacyjny, składający się z pierwszych aminokwasów ludzkiego przeciwdrobnoustrojowego peptydu laktoferryny (hLF1-11), wykazuje efekt synergistyczny lub addytywny w przypadku gatunków takich jak Cz. auris, gdy jest stosowany w połączeniu z FLU lub ANI.

Nawet w przypadku C. albicans i N. glabratus, które nie są z natury oporne na środki przeciwgrzybicze, zauważono, jak w poprzednich badaniach, że łączne stosowanie hLF(1-11) i leku przeciwgrzybiczego miało efekt addytywny, skutkujący zmniejszoną dawką leku potrzebną do zahamowania wzrostu drożdży. Ten efekt addytywny dotyczył również innych gatunków, takich jak N. glabratus i Cz. auris, które są z natury oporne na leki azolowe.

Czy wyniki badań zmieniają praktykę kliniczną?

Wyniki dotyczące potencjalnego zastosowania hLF(1-11) w połączeniu z lekami azolowymi i anidulafunginą sugerują, że wcześniej nieodpowiednie opcje leczenia przeciwgrzybiczego mogłyby zostać przywrócone ze względu na niższe wartości MIC odnotowane, gdy środek przeciwgrzybiczny jest stosowany w połączeniu z hLF(1-11). Takie leczenie może potencjalnie być rozwiązaniem w leczeniu pacjentów zakażonych opornymi izolatami.

Na przykład, Cz. auris rozwinęła różne rodzaje mechanizmów oporności. Oporność na flukonazol jest powiązana z trzema różnymi genami. Pierwszym mechanizmem jest wypompowywanie leków azolowych przez pompy pośredniczone przez mutację punktową MDR1/CDR1/CDR2. Po drugie, gen ERG 11 może być regulowany w górę lub zmutowany. Regulacja w górę ERG11 skutkuje zmniejszoną płynnością błony komórkowej i dysfunkcją błony komórkowej, a mutacja punktowa zapewnia mniejszą możliwość wiązania między flukonazolem a p450 14-α-lanosterol-demetylazą. Trzecim mechanizmem jest mutacja punktowa ERG5, która aktywuje inną ścieżkę ergosterolu, która unika interakcji z azolami. Oporność na echinokandyny może być spowodowana mutacją punktową w genach FSK1/FSK2, hamującą miejsce docelowe. Pojawiająca się oporność na echinokandyny i amfoterycynę B jest również związana z tworzeniem biofilmu, prawdopodobnie konsekwencją tworzenia powierzchni abiotycznej z aktywnością fosfolipazy i pomp efflux oraz hamowaniem biomechanicznym.

Czy wyniki tego badania mogą zmienić podejście do leczenia zakażeń wywołanych przez oporne szczepy Candida, w tym Cz. auris? Jakie wyzwania mogą pojawić się przy wdrażaniu tej metody do praktyki klinicznej? Badanie wykazało, że ludzka LF składa się z dwóch podobnych wielkościowo domen (α i β), z których pierwsza domena jest zasadowa, kationowa i amfipatyczna. Pierwsze 11 aminokwasów hLF, tj. hLF1-11, ma najsilniejszą aktywność przeciwdrobnoustrojową jako peptyd uszkadzający błony i immunomodulacyjny, i było wiadomo, że ma efekt synergistyczny dla C. albicans w połączeniu z terapią flukonazolem.

Po przejściu przez błonę komórkową patogenów drożdżowych, hLF(1-11) uwalnia Ca²⁺, który jest transportowany do mitochondriów. Ostatecznie ten transport prowadzi do ROS i uwolnienia ATP, powodując przepuszczalną ścianę komórkową i śmierć komórki. Dodatkowo, hLF(1-11) wzmacnia układ odpornościowy in vivo poprzez stymulowanie dojrzewania makrofagów i aktywację układu dopełniacza.

Testy przeciwdrobnoustrojowe z użyciem hLF(1-11) przeprowadzono, porównując komórki drożdży w fazie logarytmicznej i stacjonarnej. Badanie z użyciem C. albicans potwierdziło, że hodowle w fazie logarytmicznej dawały znaczące różnice w porównaniu do komórek w fazie stacjonarnej po dodaniu ketokonazolu lub mikonazolu, co skutkowało większym rozkładem MIC niż w innych fazach wzrostu. W testach z C. albicans nie zaobserwowano godnych uwagi różnic przy użyciu inokulum w fazie logarytmicznej lub stacjonarnej dla tego gatunku.

Badanie to wykazało wiarygodne wyniki ze względu na niską zmienność stwierdzoną wśród szczepów, ponieważ wartości MIC wahały się tylko między 12,5 μg/ml a 25 μg/ml. Zmienność wartości między tymi dwoma punktami można wytłumaczyć niewielkimi różnicami wśród badanych szczepów drożdży lub w stężeniach hLF(1-11), które mogą wpływać na reakcję utleniania AlamarBlue™ w pojedynczych próbach. Wcześniejsze badania wykazały, że metoda zmodyfikowanych testów MIC stosowana w tym badaniu jest równie wiarygodna jak standardowe wytyczne CLSI.

Protokoły EUCAST są standardowymi wytycznymi stosowanymi do testów przeciwgrzybiczych. Zalecane metody obejmują RPMI 1640, ponieważ wykazał on doskonały wzrost gatunków Candida, niezależnie od warunków inkubacji czy użytego środka przeciwdrobnoustrojowego. Dotychczas najlepsze wyniki dla przeciwgrzybiczych i przeciwbakteryjnych testów płynnych zaobserwowano z tym medium. Ogólnie rzecz biorąc, wartości MIC uzyskane w medium RPMI w tym badaniu były zgodne z wartościami uzyskanymi w poprzednich badaniach z użyciem tego samego peptydu, a użycie tego medium dało dobre wyniki zarówno dla drożdży, jak i bakterii. Obserwacje te potwierdzają więc adekwatność RPMI 1640 do zastosowania w przeprowadzonych eksperymentach.

Syntetyczny hLF(1-11) jest bezpiecznym lekiem, co wykazano, podając bezpiecznie do kilku dawek 5 mg/kg u pacjentów po przeszczepie komórek macierzystych układu krwiotwórczego. Dlatego hLF(1-11) jest obiecującym środkiem do zwalczania infekcji drożdżowych, w tym Cz. auris, ale mógłby również odegrać rolę w czyszczeniu powierzchni i zapobieganiu rozprzestrzenianiu się drożdży. “Oprócz oporności na środki przeciwgrzybicze, rozprzestrzenianie się Cz. auris jest również problemem w jej eradykacji. Transmisja odbywa się głównie poprzez zanieczyszczone powierzchnie, ponieważ Cz. auris przyczepia się do różnych powierzchni i materiałów” – podkreślają autorzy badania.

Jak sprostać wyzwaniom eradykacji opornych grzybów?

Całkowite usunięcie Cz. auris z zanieczyszczonych powierzchni jest trudne w leczeniu ze względu na właściwości przylegania i tworzenie biofilmu. Zakażone środowisko może prowadzić do wybuchu epidemii, szczególnie w szpitalach. Na przykład, oddział szpitalny w Londynie (Wielka Brytania) musiał zostać całkowicie rozebrany, ponieważ całkowita eradykacja Cz. auris okazała się niemożliwa. Dlatego kluczowe jest wczesne diagnozowanie i leczenie zakażonych pacjentów oraz poszukiwanie lokalnych źródeł drożdży. Wczesne wykrycie może również znacznie zmniejszyć rozprzestrzenianie się choroby na innych pacjentów.

Potrzebne są szersze badania z większą liczbą szczepów, aby zapewnić głębszy wgląd w mechanizm obserwowanego synergistycznego efektu przeciwgrzybiczego hLF(1-11) i azoli lub anidulafunginy. Potrzebne są również badania farmakodynamiczne, aby przetestować skuteczność hLF(1-11) samodzielnie i w połączeniu z lekami przeciwgrzybiczymi w eksperymentach na zwierzętach. Wreszcie, potrzebne są zaślepione badania kliniczne, aby poprzeć tę koncepcję synergizmu między hLF(1-11) a powszechnie stosowanymi środkami przeciwgrzybiczymi w kohortach pacjentów i kontrolnych.

Istnieją przykłady zastosowania hLF(1-11) przeciwko grzybicy paznokci, a dane wskazują, że hLF(1-11) nie wykazuje toksyczności u ludzi, a rozwój oporności przeciwko niemu wydaje się znikomy. Pojawienie się wielolekoopornych patogenów mikrobiologicznych stworzyło pilną potrzebę nowych opcji terapeutycznych, a LF i jej pochodne peptydy, laktoferrycyny (LFcins), pojawiają się jako obiecujący kandydaci ze względu na ich wieloaspektową rolę w odporności wrodzonej i patogenezie mikrobiologicznej. LF wykazuje właściwości bakteriostatyczne i bakteriobójcze, promuje odpowiedzi immunologiczne i wykazano, że hamuje dostęp wirusów oraz przeciwdziała mikrobiologicznym mechanizmom infekcji, czyniąc ją cennym adiuwantem w zwalczaniu mikroorganizmów i grzybów opornych na antybiotyki.

Badania nad potencjałem peptydów LF w hamowaniu Candida i podobnych drożdży, w tym Cz. auris, pokazują obiecujące wyniki. Peptydy LF mają silne właściwości przeciwgrzybicze, co czyni je wartościowymi kandydatami do opracowania nowych opcji leczenia. Mały peptyd LF hLF(1-11) jest uważany za obiecujący lek w interwencjach przeciwgrzybiczych, ale potrzebne jest przetestowanie jego skuteczności na zwierzętach, a ostatecznie na ludziach.

W miarę jak częstość występowania infekcji Cz. auris nadal rośnie, a oporność na środki przeciwgrzybicze staje się rosnącym problemem, eksploracja alternatywnych terapii, takich jak te wykorzystujące peptydy oparte na LF, może być znaczącym krokiem naprzód w rozwiązaniu tego wyzwania. W testach kombinacyjnych indeksy frakcyjnego stężenia hamującego [FIC] dla badanych szczepów wynosiły do 1,0, pokazując, że istnieje synergistyczny lub addytywny efekt na skuteczność flukonazolu i anidulafunginy, gdy są stosowane w połączeniu z hLF(1-11). Wartości MIC w kombinacyjnym zastosowaniu były o jeden lub dwa kroki miareczkowania niższe niż przy stosowaniu samodzielnie.

Indeksy [FIC] testów “checkerboard” wynosiły wszystkie <1, pokazując, że hLF(1-11) i leki przeciwgrzybicze flukonazol lub anidulafungina mają synergistyczno-addytywną relację. hLF(1-11) hamuje wzrost Cz. auris i innych drożdży workowych o znaczeniu klinicznym i dlatego ma obiecujące zastosowanie medyczne. Kombinacyjne użycie może być obiecujące w leczeniu infekcji wywołanych przez oporne izolaty.

Podsumowanie

Inwazyjne infekcje grzybicze stanowią coraz poważniejszy problem zdrowotny, szczególnie w przypadku pacjentów z obniżoną odpornością. Szczególnie niepokojący jest wzrost występowania Candidozyma auris, patogenu charakteryzującego się wysoką opornością na dostępne leki przeciwgrzybicze i śmiertelnością sięgającą 72%. W odpowiedzi na to zagrożenie, naukowcy zbadali skuteczność peptydu hLF(1-11), pochodzącego z ludzkiej laktoferryny. Badania wykazały, że związek ten skutecznie hamuje wzrost wszystkich testowanych szczepów grzybiczych, w tym opornych szczepów C. auris. Co więcej, peptyd wykazuje efekt synergistyczny lub addytywny w połączeniu z konwencjonalnymi lekami przeciwgrzybiczymi, takimi jak flukonazol i anidulafungina. Mechanizm działania hLF(1-11), polegający na zakłócaniu błon komórkowych i funkcji mitochondrialnych, różni się od tradycyjnych leków, co minimalizuje ryzyko rozwoju oporności. Wyniki badań sugerują, że hLF(1-11) może stanowić przełom w leczeniu opornych infekcji grzybiczych, choć konieczne są dalsze badania kliniczne potwierdzające jego skuteczność i bezpieczeństwo u pacjentów.