Peptydy Pom-1 rewolucjonizują terapię przeciwgrzybiczą

Czy peptydy zmienią oblicze terapii przeciwgrzybiczych?

Peptydy Pom-1 zwiększają skuteczność klasycznych leków przeciwgrzybiczych przy jednoczesnym zmniejszeniu ich dawki. Badacze odkryli nowatorską strategię w walce z opornymi szczepami Candida albicans, która może zrewolucjonizować leczenie zakażeń grzybiczych.

Infekcje grzybicze wywoływane przez Candida albicans stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia publicznego. Już w 2018 roku zostały one uznane za jedne z najczęstszych zakażeń krwiopochodnych na świecie, dotykając średnio około 9 na 100 000 osób. Według danych Centrum Kontroli i Prewencji Chorób (CDC) w Stanach Zjednoczonych co roku występuje około 25 000 przypadków inwazyjnych kandydemii, z alarmującą śmiertelnością wewnątrzszpitalną sięgającą 25%. Dodatkowo, około 75% kobiet doświadcza infekcji grzybiczej wywołanej przez różne gatunki z rodzaju Candida w ciągu życia, przy czym 5-8% dorosłych kobiet rozwija nawrotową kandydozę sromu i pochwy. W 85-95% tych przypadków czynnikiem etiologicznym jest właśnie C. albicans.

Choć istnieją skuteczne leki przeciwgrzybicze, takie jak echinokandyny, azole i polieny, profilaktyczne nadużywanie tych preparatów doprowadziło do rozwoju różnych mechanizmów oporności. Ponadto, stosowanie amfoterycyny B wiąże się z poważnymi działaniami niepożądanymi, w tym ostrą i przewlekłą nefrotoksycznością, która objawia się nudnościami, wymiotami, dreszczami, gorączką, nadciśnieniem lub niedociśnieniem oraz hipoksją. Z kolei flukonazol, choć powoduje mniej skutków ubocznych niż amfoterycyna B, również może wywoływać dolegliwości jelitowe, zmiany skórne oraz zaburzenia czynności wątroby, nerek i układu krwiotwórczego. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania nowych strategii terapeutycznych, które pozwoliłyby na zmniejszenie dawek klasycznych leków przeciwgrzybiczych.

Naturalne i syntetyczne peptydy przeciwdrobnoustrojowe (AMP) stanowią obiecującą klasę związków o szerokim spektrum działania przeciwko różnym patogenom, w tym grzybom. Konwencjonalne AMP działają albo poprzez tworzenie porów w błonie patogenu, albo poprzez hamowanie kluczowych szlaków metabolicznych. Klasyczny AMP działa na błonę komórkową, zaburzając jej funkcjonalną i strukturalną integralność poprzez tworzenie porów, co wpływa na żywotność komórek. Opracowano różne modele mechanistyczne opisujące produktywne wiązanie i integrację AMP z biomembranami. Mięczaki okazały się cennym źródłem potencjalnych AMP, ponieważ ich ochrona przeciwinfekcyjna opiera się wyłącznie na wrodzonym układzie odpornościowym z arsenałem peptydów przeciwdrobnoustrojowych.

Jak działają peptydy Pom-1?

W najnowszym badaniu naukowcy skupili się na peptydach Pom-1 i ich pochodnych (Pom-1 A-F), które pierwotnie wyizolowano z kubańskiego ślimaka słodkowodnego Pomacea poeyana. Wcześniejsze badania wykazały, że peptydy te mają działanie przeciwbakteryjne oraz hamują tworzenie biofilmu przez różne gatunki Candida, przy jednoczesnej niskiej cytotoksyczności wobec komórek ludzkich. Co ciekawe, peptydy te wydają się działać w sposób odmienny od klasycznych AMP – zamiast tworzyć pory w błonie komórkowej, prawdopodobnie wiążą się z epitopami powierzchniowymi, blokując struktury odpowiedzialne za kontakty komórka-komórka lub komórka-podłoże.

“Nasze badanie wykazało, że peptydy Pom-1 i ich pochodne hamują agregację komórek C. albicans w fazie planktonicznej, co prowadzi do zwiększonej podatności na działanie tradycyjnych leków przeciwgrzybiczych” – piszą autorzy badania.

Aby zweryfikować mechanizm działania peptydów Pom-1, badacze przeprowadzili symulacje dynamiki molekularnej oraz testy przepuszczalności błony komórkowej. Wyniki jednoznacznie wskazały, że w przeciwieństwie do znanych peptydów tworzących pory, Pom-1 i jego pochodne wykazują niskie powinowactwo do błony komórkowej C. albicans i nie mają zdolności do stabilnego wiązania się z nią ani tworzenia w niej porów. Choć obserwowano krótkotrwałe interakcje peptydów z błoną, charakteryzowały się one natychmiastową dysocjacją, wskazującą na ich niezwykle słabą stabilność. Analiza pozycji peptydów w różnych punktach czasowych (20, 40, 60, 80 i 100 ns) wykazała, że ani Pom-1, ani jego pochodne nie przyjmują stabilnej konformacji na błonie, co wyklucza zdolność do tworzenia porów.

Te wyniki symulacji in silico zostały potwierdzone eksperymentalnie za pomocą testu przepuszczalności błony opartego na barwnikach fluorescencyjnych o różnej wielkości cząsteczek. Podczas gdy znany peptyd przeciwdrobnoustrojowy Cm-p5 oraz detergent Triton X-100 (kontrole pozytywne) umożliwiały przenikanie barwników przez błonę komórkową C. albicans, peptyd Pom-1 całkowicie nie wykazywał zdolności do permeabilizacji komórek grzyba. Jest to kluczowa obserwacja, ponieważ tworzenie porów w błonach biologicznych stanowi główny powód znacznej cytotoksyczności klasycznych AMP wobec komórek ludzkich.

Czy połączenie peptydów z klasycznymi lekami zwiększa skuteczność leczenia?

Najważniejszym odkryciem badania jest jednak wykazanie synergistycznego działania peptydów Pom-1 z klasycznymi lekami przeciwgrzybiczymi – flukonazolem i amfoterycyną B. Badacze przetestowali różne kombinacje peptydów i leków przeciwgrzybiczych na 28 klinicznych izolatach C. albicans pochodzących z inwazyjnych zakażeń, w tym szczepach opornych na jeden lub oba leki.

Przed przystąpieniem do tych testów, badacze przeprowadzili ocenę cytotoksyczności różnych kombinacji peptydów i leków przeciwgrzybiczych wobec ludzkich fibroblastów skóry (HDF) oraz komórek nabłonka pęcherzykowego płuc (A549). Linia komórkowa A549 została wybrana jako “nadwrażliwa” na klasyczne AMP, co oznacza, że jeśli peptyd nie zabija komórek A549, to a fortiori komórki nienowotworowe skorzystają z faktu, że dany peptyd nie jest dla nich toksyczny i przeżyją jego obecność. Kombinacje peptydów z obniżonymi dawkami flukonazolu i amfoterycyny B (0,1x i 0,5x standardowej dawki) okazały się bezpieczne, z przeżywalnością komórek powyżej 70%, co jest zgodne z wytycznymi ISO 10993-5 dotyczącymi oceny biologicznej wyrobów medycznych. Tylko kombinacja peptydu Pom-1 C z amfoterycyną B w najwyższych testowanych stężeniach znacząco zmniejszyła żywotność komórek A549 do 60%.

Wyniki testów skuteczności są imponujące – kombinacja peptydów Pom-1 z połową standardowej dawki flukonazolu lub amfoterycyny B doprowadziła do całkowitego zabicia 96% badanych izolatów klinicznych. Dla porównania, sama amfoterycyna B w standardowej dawce była w pełni skuteczna tylko wobec 25% izolatów (7 z 28), a flukonazol wobec 57%. Przy stężeniu 0,5x standardowej dawki, sama amfoterycyna B była skuteczna tylko wobec 7% szczepów, podczas gdy w kombinacji z peptydami Pom-1 skuteczność wzrosła do 93% (26 z 28 szczepów). Co szczególnie istotne, kombinacja peptydów z obniżonymi dawkami klasycznych leków przeciwgrzybiczych była skuteczna nawet wobec szczepów opornych na amfoterycynę B i flukonazol.

Badacze przetestowali również wpływ peptydów Pom-1 na tworzenie biofilmu przez C. albicans. W standardowej dawce, amfoterycyna B całkowicie hamowała tworzenie biofilmu przez 52% szczepów (11 z 21). W połączeniu z peptydami Pom-1 w stężeniu 0,5x minimalnego stężenia hamującego biofilm (MBIC), skuteczność wzrosła do 86% (18 z 21 szczepów). Dla flukonazolu wyniki były podobne – kombinacja z peptydami Pom-1 (0,5x MBIC) całkowicie hamowała tworzenie biofilmu przez 18 z 21 szczepów.

Czy peptydy hamują tworzenie biofilmu?

Jak wyjaśniają peptydy Pom-1 swoją aktywność przeciwbiofilmową? Badania mikroskopowe wykazały, że komórki C. albicans traktowane peptydami Pom-1 nie tworzą agregatów ani regularnych strzępek, pozostając w fazie planktonicznej nawet po 24 godzinach inkubacji. W przeciwieństwie do tego, nieleczone komórki szybko tworzą większe struktury przypominające strzępki i agregaty komórkowe już po 30 minutach, a po 24 godzinach formują regularne biofilmy. Ta modyfikacja normalnego zachowania agregacyjnego przez peptydy Pom-1 prowadzi do zwiększonej dostępności i podatności komórek na klasyczne leki przeciwgrzybicze.

Co ciekawe, tylko jeden izolat (oznaczony jako izolat 23) wykazywał oporność na kombinację wszystkich peptydów Pom-1 z flukonazolem lub amfoterycyną B. Ten szczególny szczep był pierwotnie opisany jako upośledzony w tworzeniu regularnych biofilmów na powierzchniach plastikowych. Badanie mikroskopowe wykazało, że komórki tego izolatu nie wykazywały tendencji do agregacji ani tworzenia regularnych strzępek, co może wyjaśniać jego oporność na działanie peptydów Pom-1, które działają głównie poprzez hamowanie agregacji komórek.

Jakie kliniczne korzyści niesie strategia kombinacyjna?

Jakie są implikacje kliniczne tego odkrycia? Przede wszystkim, strategia łączenia peptydów Pom-1 z obniżonymi dawkami klasycznych leków przeciwgrzybiczych może prowadzić do zmniejszenia działań niepożądanych związanych z terapią przeciwgrzybiczą, przy jednoczesnym zachowaniu lub nawet zwiększeniu skuteczności leczenia. Jest to szczególnie istotne w przypadku amfoterycyny B, której stosowanie jest ograniczone przez jej toksyczność.

Ponadto, zdolność peptydów Pom-1 do przywracania skuteczności klasycznych leków przeciwgrzybiczych wobec szczepów opornych może stanowić przełom w leczeniu opornych infekcji grzybiczych. “Wierzymy, że połączenie peptydów przeciwbiofilmowych lub przeciwagregacyjnych z klasycznymi lekami przeciwgrzybiczymi, takimi jak flukonazol i/lub amfoterycyna B, może nie tylko otworzyć drogę do innowacyjnych strategii leczenia, nawet wobec niezwykle opornych szczepów C. albicans, ale także zainspirować udoskonalenia materiałów do leczenia ran nowej generacji” – konkludują autorzy.

Autorzy badania sugerują, że białka ściany komórkowej (CWP) C. albicans, takie jak białka podobne do aglutyniny (Als), Csa1, Eap1, Hwp1, Pga10 i Rbt5, mogą być potencjalnymi celami działania peptydów Pom-1. Białka te odgrywają ważną rolę w tworzeniu strzępek, agregacji i formowaniu biofilmu, a ich delecja prowadzi do tworzenia kruchych biofilmów lub drastycznego zmniejszenia tworzenia biofilmu. Co ciekawe, niektóre z tych białek, jak Csa1p, nie są równomiernie rozmieszczone na powierzchni komórek drożdży, ale występują głównie w rosnących pączkach, co sugeruje, że ich dystrybucja może być ograniczona do miejsc wydłużania powierzchni komórki. Ponadto, domena N-końcowa Eap1 wydaje się być odpowiedzialna za adhezję komórka-komórka drożdży, a regiony bogate w serynę/treoninę pośredniczą w adhezji do abiotycznych powierzchni polistyrenowych.

Czy ta strategia terapeutyczna znajdzie zastosowanie w praktyce klinicznej? Przed wprowadzeniem do rutynowego stosowania konieczne są dalsze badania, w tym szczegółowa charakterystyka strategii kombinacyjnej na większej liczbie próbek oraz dokładniejsza ocena immunologiczna i toksykologiczna. Należy również zbadać wpływ peptydów Pom-1 na dojrzałe/ustabilizowane biofilmy, ponieważ obecne badanie koncentrowało się głównie na wczesnych etapach rozwoju biofilmu. Zdolność do zwalczania dojrzałych biofilmów C. albicans pozostaje krytycznym i szczególnie trudnym celem ze względu na wysoką tolerancję i złożoną architekturę charakterystyczną dla tych struktur.

Jednak ze względu na silne działanie przeciwbiofilmowe, peptydy Pom-1 mogą również służyć jako wyjątkowo korzystne składniki preparatów przeciwko C. albicans nowej generacji do tzw. terapii zamkniętych (lock therapy) jako konserwatywna opcja leczenia zakażeń krwi związanych z cewnikami u pacjentów z długotrwałym cewnikowaniem. Mogą również zainspirować udoskonalenia materiałów do leczenia ran nowej generacji, które już zostały opracowane jako pierwsze linie obrony przed różnymi patogenami, w tym C. auris.

Czy nasze podejście do leczenia infekcji grzybiczych zmieni się w najbliższej przyszłości? Z pewnością odkrycie synergistycznego działania peptydów Pom-1 z klasycznymi lekami przeciwgrzybiczymi otwiera nowe możliwości terapeutyczne. Szczególnie obiecująca jest perspektywa zmniejszenia dawek toksycznych leków przy jednoczesnym zwiększeniu ich skuteczności, nawet wobec szczepów opornych. Badanie to stanowi ważny krok w kierunku opracowania bezpieczniejszych i skuteczniejszych terapii przeciwgrzybiczych.

Podsumowanie

Badania nad peptydami Pom-1, wyizolowanymi z kubańskiego ślimaka słodkowodnego Pomacea poeyana, wykazały ich znaczący potencjał w leczeniu zakażeń wywołanych przez Candida albicans. W połączeniu z konwencjonalnymi lekami przeciwgrzybiczymi, takimi jak flukonazol i amfoterycyna B, peptydy te pozwalają na zmniejszenie dawek leków przy zachowaniu lub zwiększeniu skuteczności terapii. Kombinacja peptydów z połową standardowej dawki leków doprowadziła do eliminacji 96% badanych izolatów klinicznych, w tym szczepów opornych. Peptydy Pom-1 działają poprzez hamowanie agregacji komórek C. albicans i tworzenia biofilmu, co zwiększa podatność patogenu na działanie leków. Co istotne, strategia ta charakteryzuje się niską cytotoksycznością wobec komórek ludzkich, co czyni ją bezpieczną opcją terapeutyczną. To odkrycie może stanowić przełom w leczeniu opornych infekcji grzybiczych i zainspirować rozwój nowych materiałów do leczenia ran.