Czy fotodynamiczna terapia zmienia zasady gry?
Nowa nadzieja w walce z opornymi infekcjami grzybiczymi – terapia fotodynamiczna skutecznie zwalcza Nakaseomyces glabrata oporną na azole
W ciągu ostatnich trzech dekad zaobserwowano znaczący wzrost infekcji wywołanych przez gatunki inne niż Candida albicans. Szczególnie istotnym klinicznie patogenem jest Nakaseomyces glabrata (dawniej klasyfikowany jako Candida glabrata), który został przeklasyfikowany w 2022 roku na podstawie analiz filogenetycznych i genomowych wykazujących znaczne podobieństwa z gatunkami z rodzaju Nakaseomyces, w tym zachowaną organizację genów, syntenię genów i specyficzne profile rodzin genów. Obecnie N. glabrata jest uznawany za drugi najczęstszy czynnik wywołujący kandydozę, stanowiąc od 7,4% do 21,1% klinicznych izolatów Candida. Podobnie jak inne gatunki Candida, N. glabrata jest częścią mikrobioty komensalnej człowieka i może kolonizować różne miejsca anatomiczne, w tym skórę, jamę ustną, przewód pokarmowy i układ moczowy.
Jak aPDT przełamuje mechanizmy oporności na azole?
Azole są jedyną klasą leków przeciwgrzybiczych stosowanych w długotrwałym leczeniu doustnym głębokich zakażeń grzybiczych. Mimo ich wysokiej biodostępności, szerokiego spektrum działania i korzystnego profilu bezpieczeństwa, N. glabrata wykazuje wrodzoną oporność genetyczną na azole oraz znaczną zdolność do rozwijania oporności nabytej. Dane epidemiologiczne wskazują, że 62,8%-76,7% klinicznych izolatów N. glabrata wykazuje zmniejszoną wrażliwość na flukonazol, a 8,1%-16,5% demonstruje potwierdzoną oporność na azole. Wobec rosnącego problemu oporności na leki przeciwgrzybicze, poszukiwanie alternatywnych metod leczenia staje się pilną potrzebą.
Przeciwdrobnoustrojowa terapia fotodynamiczna (aPDT) jest uznawana za skuteczną metodę w zwalczaniu infekcji wywoływanych przez trudne do leczenia patogeny. Jej działanie polega na wykorzystaniu fotouczulaczy, które po naświetlaniu laserem generują reaktywne formy tlenu (ROS) zdolne do uszkadzania wewnątrzkomórkowych biomolekuł. “Ze względu na fizyczny mechanizm działania i wielokierunkowy stres oksydacyjny, aPDT nie sprzyja indukcji oporności patogenów” – podkreślają badacze.
Jak zaprojektowano badanie z użyciem HAL-ES-aPDT?
Aby zwiększyć skuteczność tej metody, opracowano nowy fotouczulacz przeciwbakteryjny – etosomy hexyl-aminolewulinianu (HAL-ES), łączący wysoką lipofilność hexyl-aminolewulinianu (HAL) z lepszą stabilnością i przenikalnością przezskórną etosomów. Ta formulacja umożliwia głębszą penetrację tkanek i wydajną produkcję protoporfiryny IX. W porównaniu z klasycznym fotouczulaczem, kwasem 5-aminolewulinowym, HAL-ES wykazuje lepszą przenikalność i światłoczułość, co czyni go potencjalnie bezpiecznym, skutecznym i opłacalnym środkiem terapeutycznym. W poprzednich badaniach wykazano, że terapia fotodynamiczna z wykorzystaniem HAL-ES (HAL-ES-aPDT) wykazuje silne działanie przeciwdrobnoustrojowe przeciwko Propionibacterium acnes, Staphylococcus aureus i C. albicans.
W nowym badaniu naukowcy postanowili zbadać skuteczność i mechanizm działania terapii fotodynamicznej z wykorzystaniem HAL-ES (HAL-ES-aPDT) przeciwko klinicznie izolowanym szczepom N. glabrata opornym na azole. Badania przeprowadzono zarówno na referencyjnym szczepie N. glabrata ATCC 2001, jak i na klinicznych izolatach N. glabrata podzielonych na trzy grupy: wrażliwe (S1-S3, MIC ≤8 μg·ml⁻¹), o zależnej od dawki wrażliwości (I1-I3, MIC 8-64 μg·ml⁻¹) i oporne (R1-R3, MIC ≥64 μg·ml⁻¹) na flukonazol. Identyfikację gatunków przeprowadzono za pomocą automatycznej spektrometrii mas przy użyciu technologii MALDI-TOF, a następnie potwierdzono wyniki przy użyciu płytek ChromAgar.
Metodologia badania obejmowała hodowlę wszystkich szczepów N. glabrata na płytkach agarowych z podłożem YPD (0,5% ekstraktu drożdżowego, 1% Bacto-Peptone, 2% glukozy i 1,4% agaru) i inkubację w temperaturze 37°C. HAL-ES, zawierający 30% ES i 20 mM (5 mg ml⁻¹) HAL, został przygotowany zgodnie z wcześniejszym opisem. Komórki N. glabrata (1×10⁶ c.f.u.·ml⁻¹) były inkubowane z 0,125% HAL-ES w 37°C przez 1 godzinę, a następnie naświetlane laserem o długości fali 630 nm przy gęstości mocy 60 mW cm⁻² przez 30 minut z odległości 10 cm.
Czy aPDT zwiększa wrażliwość patogenów na flukonazol?
Jak terapia fotodynamiczna wpływa na odporność N. glabrata na stres środowiskowy? Wyniki testów na podłożach zawierających nadtlenek wodoru (H₂O₂), SDS i chlorek sodu (NaCl), symulujących odpowiednio stres oksydacyjny, zaburzenia błony komórkowej i wysokie ciśnienie osmotyczne, wykazały, że po leczeniu HAL-ES-aPDT kolonie formowane przez wrażliwe, pośrednie i oporne na leki szczepy N. glabrata były zredukowane w różnym stopniu na każdym podłożu wrażliwym na stres. Kolonie wykazywały wolniejsze tempo wzrostu i mniejsze rozmiary. “Nasze wyniki jednoznacznie dowodzą, że HAL-ES-aPDT zmniejsza tolerancję N. glabrata na stres oksydacyjny i warunki hiperosmotyczne, jednocześnie zwiększając wrażliwość błony komórkowej na czynniki destrukcyjne” – piszą autorzy badania.
Czy terapia fotodynamiczna może odwrócić oporność na flukonazol? Odpowiedzi dostarczyła metoda dyfuzji krążkowej Kirby-Bauera, przeprowadzona zgodnie ze standardowymi wytycznymi zalecanymi przez Instytut Standardów Klinicznych i Laboratoryjnych do oceny oporności przeciwdrobnoustrojowej. Komórki N. glabrata (1×10⁶ c.f.u.·ml⁻¹) hodowano w podłożu YPD w temperaturze 37°C przez 2 godziny w obecności lub bez HAL-ES-aPDT. Następnie kultury szczepiono na płytki agarowe Muellera-Hintona uzupełnione 2% glukozą i błękitem metylenowym (0,5 mg·ml⁻¹). Krążki z flukonazolem (25 mg) umieszczano w centrum każdej płytki, a następnie inkubowano w temperaturze 37°C przez 24 godziny. Zgodnie ze standardowymi kryteriami, oporność na flukonazol jest wskazywana przez średnicę strefy zahamowania wzrostu ≤14 mm, pośrednia wrażliwość przez średnicę między >14 a <19 mm, a pełna wrażliwość przez średnicę ≥19 mm. Po leczeniu HAL-ES-aPDT, średnice stref zahamowania wzrostu wrażliwych, pośrednich i opornych szczepów N. glabrata znacząco się zwiększyły (P<0,05), wskazując na zwiększoną wrażliwość na flukonazol. Co szczególnie istotne, średnice stref zahamowania wzrostu szczepów opornych na leki zwiększyły się do zakresu obserwowanego dla szczepów wrażliwych, sugerując, że HAL-ES-aPDT odwróciła oporność na flukonazol i przywróciła skuteczność przeciwbakteryjną.
Jakie mechanizmy molekularne kryją się za odwróceniem oporności?
Jakie mechanizmy molekularne stoją za odwróceniem oporności? Wypompowywanie leku za pośrednictwem pomp efflux jest głównym mechanizmem leżącym u podstaw oporności na azole w N. glabrata. W badaniu wykorzystano rodaminę 6G (R6G) jako fluorescencyjny substrat do oceny aktywności pompy efflux poprzez pomiar jej intensywności fluorescencji w supernatancie. Komórki N. glabrata, przygotowane przed i po leczeniu HAL-ES-aPDT w stężeniu 5×10⁷ c.f.u.·ml⁻¹, przenoszono do bulionu YPD i inkubowano w temperaturze 37°C przez 12 godzin. Następnie każdy szczep poddawano wyczerpaniu glukozy poprzez inkubację w wytrząsarce o stałej temperaturze (37°C, 200 r.p.m.) przez 2 godziny. Po odwirowaniu i usunięciu supernatantu, dodawano 1 ml 10 μM R6G i inkubowano próbki przez 2 godziny w inkubatorze CO₂ w warunkach chronionych przed światłem. Intensywność fluorescencji R6G w supernatancie mierzono przy 0,5, 1 i 2 godzinach za pomocą wielofunkcyjnego czytnika mikropłytek (wzbudzenie, 525 nm; emisja, 551 nm).
Wraz z upływem czasu (0,5, 1 i 2 godziny) intensywność fluorescencji w grupach kontrolnych stopniowo wzrastała, wskazując na aktywne wypompowywanie leku w opornych szczepach N. glabrata. Po suplementacji glukozą aktywność wypompowywania znacząco wzrosła (P<0,05), potwierdzając zaangażowanie pomp efflux zależnych od energii. Po leczeniu HAL-ES-aPDT aktywność pompy efflux była znacząco osłabiona (P<0,05). Chociaż dodanie glukozy zwiększyło aktywność wypompowywania po leczeniu, wielkość wzrostu była znacznie niższa w porównaniu z nieleczoną kontrolą (P<0,05).
Na poziomie genetycznym, analiza qPCR wykazała, że ekspresja genów regulatorowych i strukturalnych pompy efflux (PDR1, CDR1 i MDR1), genu docelowego enzymu flukonazolu (ERG11) oraz genu adhezyny nabłonkowej (EPA1) została znacząco obniżona po leczeniu HAL-ES-aPDT (P<0,05). Do ekstrakcji RNA, 2–3 ml komórek N. glabrata w logarytmicznej fazie wzrostu zbierano do probówek mikrowirowniczych 1,5 ml i wirowano przy 12 000 r.p.m. przez 30 s. Po usunięciu supernatantu i dodaniu 600 μl buforu SE (zawierającego 0,1% β-merkaptoetanolu) do delikatnego zawieszenia osadu, dodawano 100–150 U litiazy i inkubowano mieszaninę w temperaturze 37°C przez 15–30 minut w celu strawienia ściany komórkowej. Po odwirowaniu przy 13 000 r.p.m. przez 1 minutę i usunięciu supernatantu, osad komórkowy lizowano przy użyciu 350 μl buforu lizującego RLT (zawierającego 1% β-merkaptoetanolu). Do syntezy cDNA, reakcję odwrotnej transkrypcji (RT) składano na lodzie przy użyciu 2 μl 5×PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) (końcowe stężenie 1×), całkowitego RNA i RNase-free dH₂O do końcowej objętości 10 μl. Ilościowy PCR przeprowadzono przy użyciu SYBR® Premix Ex Taq™ II na systemie PCR w czasie rzeczywistym QuantStudio™ 5. ACT1 wybrano jako gen gospodarczy, a ekspresję genów znormalizowano dzieląc obfitość każdego genu docelowego przez średnią geometryczną genu gospodarczego ACT1. Średnią względną ekspresję w trzech niezależnych eksperymentach obliczono przy użyciu metody 2⁻ΔΔCt.
Wyniki te wskazują, że HAL-ES-aPDT odwraca oporność na azole w N. glabrata poprzez obniżenie ekspresji genów kodujących pompy efflux i ich regulatory, a także enzymy docelowe dla azoli. Ponadto zaobserwowana regulacja w dół EPA1 wskazuje na zmniejszenie ekspresji genów związanych z wirulencją. CDR1 jest energozależną pompą aktywnego wypompowywania, regulowaną transkrypcyjnie przez PDR1, kluczowy czynnik przyczyniający się do oporności na azole w N. glabrata. MDR1 natomiast funkcjonuje jako transporter zależny od siły protonomotorycznej, który ułatwia pasywne wypompowywanie leków wzdłuż gradientu elektrochemicznego.
Kluczowe mechanizmy działania HAL-ES-aPDT:
- Osłabia aktywność pomp efflux odpowiedzialnych za oporność na azole
- Zmniejsza ekspresję genów PDR1, CDR1 i MDR1 związanych z opornością
- Redukuje ekspresję genu EPA1 odpowiedzialnego za wirulencję
- Zwiększa wrażliwość N. glabrata na stres środowiskowy
- Przywraca skuteczność działania flukonazolu wobec opornych szczepów
Czy aPDT osłabia wirulencję in vivo?
Czy te zmiany przekładają się na zmniejszoną wirulencję in vivo? Galleria mellonella służy jako szeroko akceptowany model in vivo do badania zakażeń Candida ze względu na wrodzoną odpowiedź immunologiczną, która ściśle przypomina odpowiedź ssaków, co czyni ją odpowiednią do oceny środków przeciwgrzybiczych. Do ustanowienia odpowiedniego modelu zakażenia G. mellonella, wybrano larwy w wieku około 6 tygodni, o długości 2–3 cm i wadze około 300 mg, zapewniając porównywalny poziom żywotności we wszystkich grupach. Każda grupa eksperymentalna składała się z 10 larw. Strzykawkę mikrolitrową używano do wstrzyknięcia 10 μl zawiesiny grzybów do czwartego segmentu brzusznego po lewej stronie larw. Po inokulacji larwy umieszczano z powrotem w indywidualnych szalkach Petriego i inkubowano w temperaturze 37°C. Przeżywalność monitorowano w 24-godzinnych odstępach przez 120 godzin.
W grupach wrażliwych i pośrednich 5-dniowy wskaźnik przeżycia larw zakażonych N. glabrata wahał się od 0% do 50%. Leczenie HAL-ES-aPDT znacząco zwiększyło wskaźniki przeżycia do 80%-100% (P<0,05). W grupie opornej na leki wskaźnik przeżycia 1 dzień po zakażeniu wynosił 0%. HAL-ES-aPDT podniósł jednodniowy wskaźnik przeżycia do 60%-100% (P<0,05), podczas gdy 5-dniowy wskaźnik przeżycia pozostał na poziomie 20%-60% (P<0,05). Wyniki te wskazują, że HAL-ES-aPDT znacząco zmniejsza wirulencję in vivo N. glabrata we wszystkich grupach szczepów: wrażliwych, pośrednich i opornych na leki.
Czy fotodynamiczna terapia to przełom w leczeniu zakażeń grzybiczych?
Czy terapia fotodynamiczna może stać się przełomem w leczeniu opornych infekcji grzybiczych? “Nasze badania wykazały, że HAL-ES-aPDT zwiększa wrażliwość N. glabrata na stresy środowiskowe, odwraca jej wrodzoną oporność na azole i osłabia jej wirulencję in vivo” – konkludują badacze. Ze względu na podobieństwa w mechanizmach farmakologicznych azoli, HAL-ES-aPDT prawdopodobnie wykaże porównywalne lub wzmocnione efekty synergistyczne w połączeniu z worykonazolem lub posakonazolem przeciwko opornym na azole szczepom.
Zakażenia grzybicze są często nawracające i wymagają długotrwałego leczenia przeciwgrzybiczego, co może prowadzić do poważnych działań niepożądanych i rozwoju oporności na leki. Dlatego łączenie środków przeciwgrzybiczych z aPDT przedstawia obiecującą strategię. Podejście to może zmniejszyć wymaganą dawkę leku, ograniczyć pojawianie się szczepów opornych, a tym samym rozwiązać problem oporności przeciwgrzybiczej.
Czy różnice w regulacji biofilmu wpływają na wirulencję?
Ponieważ N. glabrata rzadko tworzy solidne biofilmy, a jej oporność na azole wynika głównie z wewnętrznej regulacji w górę pompy efflux, a nie z czynników specyficznych dla biofilmu, badania skoncentrowano na zmianach pompy efflux na poziomie planktonicznym. W przeciwieństwie do C. albicans, która głównie rozwija oporność na azole poprzez tworzenie biofilmu (mechanizm nabytej oporności), N. glabrata wykazuje wrodzoną oporność na azole w dużej mierze przypisywaną nadekspresji pomp efflux.
Epithelial adhesin EPA1 odgrywa kluczową rolę w wirulencji C. glabrata poprzez zwiększenie adhezji do komórek nabłonkowych gospodarza. Jego ekspresja jest regulowana przez czynnik transkrypcyjny PDR1. W tym badaniu leczenie HAL-ES-aPDT znacząco obniżyło ekspresję EPA1 i PDR1 w N. glabrata, co skutkowało zwiększonym wskaźnikiem przeżycia G. mellonella zakażonej wrażliwymi, pośrednimi i opornymi na leki szczepami N. glabrata.
Zalety i ograniczenia terapii HAL-ES-aPDT:
- Zalety:
- Skuteczność potwierdzona in vivo (80-100% przeżywalność w modelu G. mellonella)
- Bezpieczeństwo kliniczne składników (HAL i etosom)
- Brak indukcji oporności patogenów
- Ograniczenia:
- Wyłącznie zastosowanie miejscowe
- Ograniczona penetracja tkanek
- Konieczność optymalizacji dawkowania
Jakie są perspektywy i ograniczenia nowej metody?
Jakie są ograniczenia i perspektywy tej metody? HAL i etosom są klinicznie bezpieczne, jednak HAL-ES-aPDT jest przeznaczony wyłącznie do użytku miejscowego, a zmienne takie jak penetracja tkanek i jednorodność światła ograniczają jego zastosowanie w infekcjach ogólnoustrojowych. Obecnie, oprócz klasycznego leku flukonazolu, w klinice stosowane są takie leki jak worykonazol i posakonazol do zwalczania zakażeń grzybiczych. Ze względu na podobieństwa w mechanizmach farmakologicznych azoli, HAL-ES-aPDT prawdopodobnie wykaże porównywalne lub wzmocnione efekty synergistyczne w połączeniu z tymi lekami przeciwko opornym na azole szczepom. Jednak mechanizmy oporności mogą różnić się w zależności od gatunku grzyba, co wymaga dalszych badań.
Ponadto, jako nowa terapia przeciwdrobnoustrojowa, kliniczne zastosowanie aPDT wymaga dalszej optymalizacji, w tym doboru fotouczulaczy i odpowiednich dawek światła dostosowanych do indywidualnych przypadków. Badania wykazały, że HAL-ES-aPDT działa jak złożony, wielokierunkowy atak, dostarczający wiele stresorów, które nie indukują ochrony krzyżowej przeciwko tym stresorom, co jest korzystne dla ograniczenia oporności adaptacyjnej i zmniejszenia prawdopodobieństwa wystąpienia opornych mutacji N. glabrata.
Czy możemy więc oczekiwać nowej ery w leczeniu opornych infekcji grzybiczych? Badania nad HAL-ES-aPDT otwierają obiecujące perspektywy, ale konieczne są dalsze badania nad trwałością efektów, optymalizacją dawkowania oraz potencjałem w leczeniu różnych patogenów grzybiczych. Czy ta innowacyjna terapia stanie się standardem w praktyce klinicznej? Czas pokaże, ale pierwsze wyniki dają powody do optymizmu w walce z rosnącym problemem oporności na leki przeciwgrzybicze.
Podsumowanie
Przeciwdrobnoustrojowa terapia fotodynamiczna z wykorzystaniem etosomów hexyl-aminolewulinianu (HAL-ES-aPDT) wykazuje znaczącą skuteczność w zwalczaniu opornych na azole szczepów Nakaseomyces glabrata. Badania laboratoryjne potwierdziły, że terapia ta skutecznie zwiększa wrażliwość patogenów na flukonazol poprzez osłabienie mechanizmów oporności, w tym zmniejszenie aktywności pomp efflux i obniżenie ekspresji genów odpowiedzialnych za oporność (PDR1, CDR1, MDR1). Dodatkowo, HAL-ES-aPDT zmniejsza ekspresję genu EPA1 związanego z wirulencją patogenu. Skuteczność metody została potwierdzona w modelu in vivo na Galleria mellonella, gdzie zaobserwowano znaczący wzrost wskaźników przeżycia zakażonych organizmów. Mimo że terapia jest obecnie ograniczona do zastosowań miejscowych, wyniki badań sugerują, że może ona stanowić przełom w leczeniu opornych infekcji grzybiczych, szczególnie w połączeniu z konwencjonalnymi lekami przeciwgrzybiczymi.
