Sfingolipidy kluczem do zrozumienia oporności Candida auris

Czy sfingolipidy kryją tajemnice oporności Candida auris?

Zmiany w profilu sfingolipidów mogą być kluczem do zrozumienia oporności Candida auris na flukonazol – wskazują najnowsze badania. To przełomowe odkrycie może pomóc w opracowaniu nowych strategii terapeutycznych przeciwko temu groźnemu patogenowi.

Wielolekooporna Candida auris stanowi obecnie jedno z największych wyzwań w leczeniu zakażeń grzybiczych na całym świecie. Ten patogen szybko rozprzestrzenia się w placówkach opieki zdrowotnej i wykazuje niezwykłą zdolność do przetrwania na powierzchniach i pościeli. Dane epidemiologiczne są alarmujące – badania wieloośrodkowe wykazały, że około 93% izolatów C. auris jest opornych na flukonazol (FLC), około 35% na amfoterycynę B, 41% wykazuje oporność na oba te leki, a około 4% jest opornych na wszystkie trzy główne klasy leków przeciwgrzybiczych. Dotychczas znane mechanizmy oporności, takie jak mutacje w genie ERG11 (kodującym 14α-demetylazę) czy nadekspresja genów transporterów leków (CDR1, CDR2, MDR1), nie wyjaśniają w pełni wysokiego poziomu oporności obserwowanego u C. auris.

Naukowcy zwrócili uwagę na rolę lipidów błonowych, w szczególności sfingolipidów (SL), jako potencjalnych modulatorów oporności na leki przeciwgrzybicze. “Podczas gdy konwencjonalne leki przeciwgrzybicze, takie jak azole i polieny, celują głównie w ergosterol, zmiany w klasach sfingolipidów sugerują, że te biomolekuły, wraz z ergosterolem, są kluczowymi składnikami lipidowymi, które oddziałują w obrębie domeny błonowej” – wyjaśniają autorzy badania. Wcześniejsze obserwacje u Candida albicans wykazały, że delecja specyficznych genów biosyntezy SL zwiększała podatność na leki przeciwgrzybicze i zakłócała lokalizację głównych białek transportujących leki.

Sfingolipidy pełnią kluczowe funkcje w fizjologii drożdży, uczestnicząc w organizacji błony komórkowej, transdukcji sygnału i odpowiedzi na stres. Długołańcuchowe zasady (LCB), będące kluczowymi pośrednikami w biosyntezie SL, w tym dihydrosfingozyna (DHS), fitosfingozyna (PHS) i ich formy fosforylowane, są zaangażowane w wewnątrzkomórkową sygnalizację. Dodatkowo, specyficzne cząsteczki SL, takie jak glukozylceramid (GlcCer) i fosfoceramid inozytolu, przyczyniają się do patogenezy i wirulencji grzybów.

Czy eksperymentalna ewolucja odsłania nowe mechanizmy oporności?

W najnowszym badaniu naukowcy zastosowali nowatorskie podejście – eksperymentalną ewolucję szczepów C. auris pod wpływem FLC. Wykorzystali dwa szczepy z klady II (oznaczone jako linia C i linia P), które poddali działaniu sublatalnych stężeń FLC przez około 100 pokoleń. W rezultacie otrzymali stabilne linie oporne na FLC, które następnie poddali szczegółowej analizie lipidomicznej.

Metodyka badania była rygorystyczna. Szczepy C. auris CBS10913T (linia C) o początkowym MIC₅₀ dla FLC wynoszącym 8 µg/ml oraz NCCPF 470296 (linia P) o MIC₅₀ 16 µg/ml poddano eksperymentalnej ewolucji zgodnie z protokołem opisanym przez Gersteina i Bermana. Hodowle prowadzono przez 72 godziny w obecności FLC, wykonując łącznie 10 pasaży, co odpowiadało około 100 pokoleniom. Po każdych 10 pokoleniach pobierano próbki komórek do dalszych analiz. Testy MIC przeprowadzono zgodnie z zaleceniami CLSI, a kinetykę wzrostu oceniano przy użyciu systemu Tecan.

Wyniki były zaskakujące. Już na poziomie wyjściowym dwa szczepy progenitorowe (C1 i P1) wykazywały znaczące różnice w składzie sfingolipidów. W szczepie C1 dominującą klasą SL był α-hydroksyglukozylceramid (αOHGlcCer, ~49%), podczas gdy w P1 przeważał fytoceramid (PhytoCer, ~53%). “Ta heterogeniczność wewnątrz klady na poziomie profili kompozycyjnych SL podkreśla wewnętrzne różnice metaboliczne, które mogą predysponować izolaty do różnych ścieżek rozwoju oporności” – podkreślają badacze.

Co więcej, adaptowane linie oporne na FLC (C1.1 i P1.1) wykazywały charakterystyczne zmiany w profilach SL. W linii C1.1 zaobserwowano znaczący spadek poziomu αOHGlcCer (z ~49% do ~35,5%) przy jednoczesnym wzroście poziomu PhytoCer (z ~40% do ~50%). Podobnie w linii P1.1 odnotowano wzrost poziomu PhytoCer (z ~53% do >64%). Analiza składników głównych (PCA) potwierdziła statystycznie istotne różnice między progenitorami a adaptowanymi liniami na podstawie składu klas SL.

W przypadku linii C, pierwsze trzy komponenty PCA (PC1, PC2 i PC3) wyjaśniały odpowiednio 99%, 0,9% i 0,1% wariancji. Dominacja PC1 wskazuje na znaczącą segregację między progenitorem C1 a adaptorem C1.1 na podstawie składu klas SL. Zwiększony poziom PhytoCer i zmniejszony GlcCer okazały się najbardziej zmiennymi klasami SL w adaptorze C1.1 w porównaniu z jego progenitorem. Dane wskazują, że neutralna gałąź metabolizmu SL jest głównie dotknięta podczas adaptacji oporności na FLC w linii C.

Dla linii P, PC1, PC2 i PC3 odpowiadały za 93,6%, 5,2% i 1,2% wariancji. Komponenty te odzwierciedlają szerszy rozkład zmienności w linii P w porównaniu z linią C, podkreślając różnice w rozkładach klas SL między adaptorem P1.1 a progenitorem P1. Kluczowymi czynnikami wpływającymi na zmienność były zwiększone poziomy PhytoCer i zmniejszone poziomy αOHPhytoCer w adaptorze P1.1.

Szczególnie interesujące były zmiany na poziomie poszczególnych gatunków molekularnych SL. W linii C1.1 zaobserwowano selektywne wzbogacenie łańcuchów acylowych 24C w klasach PhytoCer i αOHPhytoCer. Z kolei w linii P1.1 dominującym gatunkiem PhytoCer stał się C26:0, który zastąpił C24:0, co wskazuje na preferencję dla dłuższych łańcuchów acylowych.

W adaptorze C1.1 dominującymi gatunkami molekularnymi w klasie PhytoCer były C24:0 i C26:0, przy czym tylko poziomy C24:0 wykazywały znaczący wzrost w porównaniu z progenitorem C1. Podobny trend zaobserwowano w klasie αOHPhytoCer, gdzie gatunek C24:0(OH) był jedynym gatunkiem molekularnym, który wykazywał znaczący wzrost, podczas gdy inne gatunki pozostały niezmienione. Te zmiany kompozycyjne wskazują, że 24C łańcuchy acylowe PhytoCer i αOHPhytoCer były preferencyjnie wzbogacane w adaptorze C1.1 podczas procesu ewolucji lekowej.

W adaptorze P1.1 zaobserwowano również znaczący wzrost klasy PhytoCer. W przeciwieństwie do C1.1, C26:0 wyłonił się jako dominujący gatunek, który wykazał niezwykły wzrost (z 12,6% w P1 do 39,3% w P1.1), zastępując C24:0, który był najbardziej obfity w P1. Podobny trend zaobserwowano dla C28:0, który wzrósł z 1,7% w P1 do 4,5% w P1.1. Natomiast poziomy C24:0 i C18:0 PhytoCer spadły odpowiednio z 37,5% i 1,6% w P1 do 18,6% i 1,2% w P1.1.

Jak wyniki lipidomiczne przekładają się na diagnostykę i terapię?

Równolegle przeprowadzona analiza steroli wykazała, że ergosterol stanowił ponad 80% całkowitej zawartości steroli komórkowych w obu liniach. Jednak w linii C1.1 zaobserwowano spadek całkowitej zawartości steroli, głównie z powodu zmniejszenia poziomu ergosterolu, co jest zgodne z mechanizmem działania azoli. Natomiast w linii P1.1 odnotowano ponad 20% wzrost całkowitej zawartości steroli w porównaniu z progenitorem P1, głównie z powodu podwyższonego poziomu ergosterolu.

Progenitor linii C wykazywał znacznie wyższą całkowitą zawartość steroli niż jego adaptowany szczep C1.1. Ergosterol był dominującym sterolem (>80%) w progenitorze linii C, a następnie lanosterol, ergosta-5,7-dienol i episterol, podczas gdy inne pośredniki sterolowe były obecne w mniejszych ilościach. Po 100 pokoleniach ekspozycji na FLC, całkowita zawartość steroli została zmniejszona w adaptorze C1.1, specyficznie napędzana spadkiem poziomów ergosterolu, bez wpływu na stężenia innych pośredników sterolowych.

W przeciwieństwie do tego, adaptor P1.1 wykazywał ponad 20% wzrost całkowitej zawartości steroli w porównaniu z jego progenitorem P1. Jednakże ergosterol pozostał dominującym sterolem zarówno w komórkach P1, jak i P1.1, a następnie ergosta-5,7-dienol, podczas gdy inne pośredniki sterolowe były obecne w stosunkowo mniejszych ilościach. Po ekspozycji na FLC, wzrost całkowitej zawartości steroli w adaptorze P1.1 był głównie napędzany podwyższonymi poziomami ergosterolu, bez znaczących zmian obserwowanych w innych pośrednikach sterolowych.

Czy wyniki te mogą zmienić nasze podejście do leczenia zakażeń wywołanych przez oporne szczepy C. auris? Badacze sugerują, że modulacja składu sfingolipidów może stanowić nowy cel terapeutyczny. “Nasze badania wzmacniają argumenty za sfingolipidami jako kluczowymi determinantami wielolekooporności u C. auris. Wspólną cechą, mimo heterogeniczności kompozycyjnej SL między dwoma progenitorami i ich ewoluowanymi liniami, był zwiększony poziom PhytoCer, który konsekwentnie wiązał się z opornością na FLC w obu niezależnie ewoluowanych adaptorach” – podsumowują autorzy.

Co istotne, kwasowe sfingolipidy, które odgrywają kluczową rolę w fizjologii drożdży, są nieobecne u ludzi, co czyni je atrakcyjnymi celami terapeutycznymi. Mogą one wpływać na sztywność błony, regulację wypływu leków i adaptację do stresu, co ma bezpośrednie przełożenie na oporność przeciwgrzybiczą. Kwasowe SL uczestniczą w szlakach takich jak kaskada sygnalizacyjna Pkh1/2-Ypk1, która reguluje homeostazę błony i odpowiedź przeciwgrzybiczą.

Autorzy badania podkreślają, że chociaż homeostaza steroli jest kluczowym czynnikiem w oporności na azole, istotne dowody wskazują, że oporność może również pojawić się niezależnie od modulacji steroli. W ich badaniu, szczepy ewoluowane pod wpływem FLC i ich progenitory wykazywały w dużej mierze podobne profile sterolowe, podczas gdy szczepy adaptowane wykazywały znaczące przeprogramowanie składu SL. Te odkrycia podkreślają centralną rolę SL w ewolucji oporności na FLC u Candida auris, zgodnie z obserwacjami z klinicznych izolatów opornych na FLC.

Dla lekarzy wyniki te mają istotne implikacje praktyczne. Monitorowanie zmian lipidowych w szczepach C. auris może wspierać wczesne wykrywanie mechanizmów oporności. Ponadto, inhibitory biosyntezy sfingolipidów mogłyby stanowić cenne uzupełnienie istniejących terapii przeciwgrzybiczych. Badacze podkreślają jednak potrzebę dalszych badań na szerszej grupie izolatów i z wykorzystaniem różnych leków przeciwgrzybiczych, aby w pełni zrozumieć rolę sfingolipidów w oporności C. auris i opracować skuteczne strategie terapeutyczne.

Autorzy przyznają, że badanie ma pewne ograniczenia. Eksperymenty oparto na tylko dwóch niezależnych progenitorach wrażliwych na leki i jednym leku przeciwgrzybiczym, FLC, do eksperymentalnej ewolucji. Szersze wnioski będą wymagały walidacji przy użyciu bardziej zróżnicowanego zestawu izolatów i dodatkowych leków przeciwgrzybiczych z grupy triazoli. Ponadto, wysoki stopień heterogeniczności obserwowany w profilach SL między dwoma szczepami progenitorowymi komplikuje interpretację danych lipidomicznych, utrudniając rozróżnienie zmian specyficznych dla oporności od zmienności metabolicznej tła lub różnic związanych z miejscem izolacji.

Jakie wyzwania stoją przed nami w wykorzystaniu tej wiedzy w praktyce klinicznej? Kluczowe będzie opracowanie metod diagnostycznych pozwalających na szybką ocenę profilu sfingolipidowego patogenów oraz stworzenie leków selektywnie modulujących biosyntezę sfingolipidów u grzybów bez wpływu na komórki gospodarza. Niemniej jednak, przedstawione badania otwierają nowe, obiecujące perspektywy w walce z opornymi na leki zakażeniami grzybiczymi.

Podsumowanie

Badania wykazały, że zmiany w profilu sfingolipidów odgrywają kluczową rolę w rozwoju oporności Candida auris na flukonazol. Naukowcy przeprowadzili eksperymentalną ewolucję dwóch szczepów C. auris przez około 100 pokoleń pod wpływem flukonazolu. Analiza lipidomiczna wykazała znaczące różnice w składzie sfingolipidów między szczepami wyjściowymi a opornymi, ze szczególnym uwzględnieniem wzrostu poziomu fytoceramidu. Odkryto również zmiany w długości łańcuchów acylowych sfingolipidów w szczepach opornych. Co istotne, kwasowe sfingolipidy, nieobecne u ludzi, mogą stanowić potencjalny cel terapeutyczny. Wyniki badań sugerują, że monitorowanie zmian lipidowych może wspierać wczesne wykrywanie mechanizmów oporności, a inhibitory biosyntezy sfingolipidów mogłyby stanowić cenne uzupełnienie istniejących terapii przeciwgrzybiczych.