Czy surfaktant gemini może zwiększyć bezpieczeństwo pacjentów?
W niniejszym badaniu laboratoryjnym oceniano aktywność przeciwdrobnoustrojową i przeciwbiofilmową surfaktantu kationowego typu gemini opartego na argininie (C9(LA)2) przeciwko mieszanym biofilmom opornych na flukonazol szczepów Candida albicans oraz produkujących beta-laktamazy o rozszerzonym spektrum (ESBL) szczepów Escherichia coli. Badanie miało na celu opracowanie nowej strategii zapobiegania zakażeniom związanym z cewnikami naczyniowymi.
Biofilmy są definiowane jako społeczności mikroorganizmów przylegające do powierzchni biotycznych lub abiotycznych i otoczone zewnątrzkomórkową macierzą polimerową. Mogą być tworzone przez pojedyncze lub wielogatunkowe społeczności, a także między różnymi królestwami. Badania wykazały, że oportunistyczny patogenny drożdżak C. albicans może tworzyć polimikrobialne biofilmy z różnymi bakteriami, zarówno in vitro, jak i in vivo.
Zakażenia związane z cewnikami naczyniowymi stanowią poważny problem kliniczny, prowadząc do zakażeń krwi i zwiększając śmiertelność oraz koszty opieki medycznej. C. albicans jest jednym z głównych patogenów związanych z zakażeniami krwi związanymi z cewnikami (CRBSI), a około 30-60% zakażeń C. albicans występuje jednocześnie z innymi patogenami. Dodatkowo, E. coli stopniowo wyprzedza bakterie Gram-dodatnie jako dominujące źródło CRBSI.
- Wykazuje silne działanie przeciwgrzybicze (MIC 4-5,3 µg/ml dla C. albicans)
- Skuteczny przeciwko bakteriom E. coli (MIC 85,3-298,7 µg/ml)
- Redukuje tworzenie biofilmów o 98% przy stężeniu 32 µg/ml
- Charakteryzuje się wysokim bezpieczeństwem dla komórek ludzkich (IC50 >500 µg/ml)
- Mechanizm działania oparty na destabilizacji błon komórkowych utrudnia rozwój oporności
Jakie metody stosowano w ocenie aktywności przeciwdrobnoustrojowej?
Badanie obejmowało ocenę aktywności przeciwdrobnoustrojowej C9(LA)2 wobec planktonicznych komórek opornych na leki szczepów klinicznych oraz ich mieszanych biofilmów. Testowano osiem izolatów klinicznych: cztery oporne na flukonazol szczepy C. albicans i cztery produkujące ESBL szczepy E. coli, a także szczepy referencyjne ATCC jako kontrole. Badano również hydrożel zawierający C9(LA)2 w kontekście impregnacji centralnych cewników żylnych (CVC).
Surfaktant C9(LA)2 składa się z dwóch monomerycznych amfifili opartych na argininie połączonych łącznikiem złożonym z dziewięciu grup CH2 na poziomie ich głowy. Związek ten był bardzo skuteczny w zmniejszaniu napięcia powierzchniowego, z bardzo niską krytyczną wartością stężenia micelarnego (CMC) wynoszącą 2,8 μM, i wykazywał interesujące działanie przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze. Ponadto tworzy lepkie roztwory wodne zawierające duże agregaty, takie jak micele helikalnych lub robakokształtnych.
Surfaktant C9(LA)2 wykazał bardzo dobrą aktywność przeciwko szczepom C. albicans, z wartościami MIC (minimalne stężenie hamujące) między 4-5,3 µg/ml. Dla izolatów E. coli wartości MIC wahały się od 85,3 do 298,7 µg/ml. Stosunek MFC/MIC (minimalne stężenie grzybobójcze do MIC) wynosił między 1,0 a 1,7, a stosunek MBC/MIC (minimalne stężenie bakteriobójcze do MIC) między 1,0 a 1,2, co wskazuje na działanie grzybobójcze i bakteriobójcze surfaktantu. Mechanizm działania prawdopodobnie opiera się na interakcji z błonami komórkowymi mikroorganizmów, co jest istotną zaletą, ponieważ utrudnia rozwój oporności.
Interakcja kationowych surfaktantów z bakteriami i grzybami obejmuje dwa etapy: (a) przyłączenie do błony biologicznej poprzez oddziaływania elektrostatyczne między ładunkiem kationowym głowy polarnej a ujemnie naładowanymi cząsteczkami w błonach bakteryjnych/grzybiczych; oraz (b) oddziaływania hydrofobowe między łańcuchem alkilowym surfaktantów a dwuwarstwami lipidowymi błon. Komponenty anionowe w błonie wewnętrznej stanowią około 26% dla E. coli, a zewnętrzna warstwa błony E. coli jest zdominowana przez lipopolisacharydy (LPS), które wykazują wielokrotne ładunki ujemne. Te LPS mogą skutecznie pochłaniać przeciwnie naładowane i hydrofobowe cząsteczki, powodując wyższe wartości MIC przeciwko bakteriom niż szczepom Candida.
- Impregnacja samym surfaktantem redukuje biofilm C. albicans o 62% i E. coli o 48,7%
- Połączenie z hydrożelem zwiększa skuteczność do 71,7% dla C. albicans i 86,7% dla E. coli
- Hydrożel wzmacnia działanie surfaktantu poprzez lepszą przyczepność i przedłużone uwalnianie
- Metoda może znacząco zmniejszyć ryzyko zakażeń związanych z cewnikami naczyniowymi
Czy impregnacja CVC rewolucjonizuje walkę z biofilmami?
W badaniach na płytkach 96-dołkowych C9(LA)2 całkowicie hamował tworzenie się mieszanych biofilmów testowanych szczepów. Już przy najniższym badanym stężeniu (32 µg/ml) zaobserwowano około 98% redukcję liczby jednostek tworzących kolonię (CFU) obu mikroorganizmów w porównaniu z kontrolą. Przy wyższych stężeniach surfaktantu odnotowano całkowitą eliminację C. albicans oraz prawie całkowitą eliminację E. coli przy stężeniach >64 µg/ml.
Mieszane zakażenia wywołane przez Candida i bakterie są bardziej patogenne niż zakażenia jednym gatunkiem. Leczenie mieszanych biofilmów grzybiczych i bakteryjnych stanowi znaczące wyzwanie ze względu na ich różne wzorce oporności i dynamiczne interakcje międzykrólestwowe. E. coli i C. albicans często współistnieją w ludzkich tkankach i płynach ustrojowych, ale badania nowych strategii usuwania tych mieszanych biofilmów są rzadkie w literaturze.
Dobra aktywność przeciwbiofilmowa tego surfaktantu gemini może być przypisana jego znaczącej aktywności powierzchniowej i ładunkowi kationowemu umiejscowionemu w grupie guanidynowej. Skuteczność przeciwko E. coli w mieszanych biofilmach jest nawet lepsza niż ta obserwowana w komórkach planktonicznych. Wysoka zdolność do eradykacji biofilmów przez te kationowe surfaktanty wydaje się wynikać z destabilizacji zewnątrzkomórkowej macierzy polimerowej poprzez oddziaływania elektrostatyczne, rozpraszające biofilm i prowadzące do śmierci komórek planktonicznych.
Impregnacja fragmentów CVC samym surfaktantem C9(LA)2 oraz surfaktantem załadowanym w hydrożel znacząco zapobiegała tworzeniu się mieszanych biofilmów w porównaniu z kontrolą. Formuła hydrożelowa wykazała lepszą aktywność przeciwbiofilmową. W przypadku impregnacji samym C9(LA)2 zaobserwowano redukcję CFU o 62% dla C. albicans i 48,7% dla E. coli. Natomiast przy impregnacji hydrożelem zawierającym surfaktant redukcja wynosiła 71,7% dla C. albicans i 86,7% dla E. coli.
Hydrożele jako powłoki cewników moczowych zostały już opisane w literaturze. Ze względu na połączenie miękkości, smarowności i funkcjonalnych struktur sieciowych, które mogą przenosić różne substancje, hydrożele mają szeroki zakres zastosowań w urządzeniach medycznych. CVC impregnowany hydrożelem na bazie gemini wzmocnił efekt surfaktantu, na co wskazuje większa redukcja wartości CFU dla fragmentów CVC impregnowanych hydrożelem w porównaniu z redukcją osiągniętą przy fragmentach impregnowanych samym C9(LA)2 w stosunku do ich odpowiednich kontroli.
Obserwacje mikroskopowe (SEM) potwierdziły dane uzyskane z liczenia kolonii. W fragmentach CVC impregnowanych C9(LA)2 zaobserwowano zmniejszenie liczby komórek mikroorganizmów z obecnością uszkodzeń komórkowych, podczas gdy fragmenty impregnowane hydrożelem zawierającym surfaktant wykazały drastyczne zmniejszenie gęstości komórek.
W badaniach cytotoksyczności C9(LA)2 nie hamował proliferacji limfocytów krwi obwodowej po 24-godzinnej inkubacji w żadnym z testowanych stężeń (do 500 µg/ml), co wskazuje na bardzo wysoką wartość IC50 (>500 µg/ml). Jest to stężenie znacznie wyższe niż wartości MIC uzyskane dla wszystkich testowanych mikroorganizmów, co demonstruje dobrą selektywność surfaktantu wobec bakterii i grzybów oraz bardzo wysoki indeks terapeutyczny (TI = IC50/MIC) dla wszystkich testowanych gatunków Candida. Biorąc pod uwagę wartości MIC, surfaktant wykazał TI > 185 dla Candida i TI > 1,6 dla E. coli.
Wyniki badania sugerują, że impregnacja CVC kationowym surfaktantem gemini C9(LA)2 może modyfikować właściwości hydrofobowe powierzchni cewnika, skutecznie hamując rozwój mieszanych biofilmów C. albicans/E. coli. Wzmocniony efekt przeciwbiofilmowy zaobserwowano, gdy fragmenty CVC były impregnowane hydrożelem zawierającym surfaktant gemini. Biorąc pod uwagę mechanizm działania i biodegradowalność związku, rozwój opornych mikroorganizmów na proponowaną substancję przeciwbiofilmową jest mało prawdopodobny.
Przedstawione badanie stanowi pierwszy krok w kierunku eksploracji zdolności kationowych surfaktantów gemini do hamowania wzrostu biofilmów międzykrólestwowych na urządzeniach medycznych, co może przyczynić się do redukcji zakażeń związanych z cewnikami centralnymi.
Podsumowanie
Przeprowadzone badanie laboratoryjne koncentrowało się na ocenie skuteczności surfaktantu kationowego typu gemini C9(LA)2 w zwalczaniu mieszanych biofilmów tworzonych przez oporne na flukonazol szczepy Candida albicans oraz produkujące ESBL szczepy Escherichia coli. Związek wykazał znaczącą aktywność przeciwdrobnoustrojową, szczególnie wobec C. albicans (MIC 4-5,3 µg/ml) oraz E. coli (MIC 85,3-298,7 µg/ml). Surfaktant skutecznie hamował tworzenie się biofilmów, osiągając 98% redukcję jednostek tworzących kolonię przy stężeniu 32 µg/ml. Impregnacja cewników centralnych hydrożelem zawierającym surfaktant zwiększyła skuteczność działania, prowadząc do redukcji CFU o 71,7% dla C. albicans i 86,7% dla E. coli. Co istotne, związek wykazał wysokie bezpieczeństwo dla komórek ludzkich (IC50 >500 µg/ml) oraz niskie prawdopodobieństwo rozwoju oporności ze względu na mechanizm działania oparty na destabilizacji błon komórkowych. Badanie stanowi obiecujący krok w kierunku opracowania skutecznej metody zapobiegania zakażeniom związanym z cewnikami naczyniowymi.
Bibliografia
Pérez Lourdes, da Silva Cecília Rocha, do Amaral Valente Sá Lívia Gurgel, Neto João Batista de Andrade, Cabral Vitória Pessoa de Farias, Rodrigues Daniel Sampaio, Moreira Lara Elloyse Almeida, Silveira Maria Janielly Castelo Branco, Ferreira Thais Lima, da Silva Anderson Ramos, Cavalcanti Bruno Coêlho, Ricardo Nágila Maria Pontes Silva, Rodrigues Francisco Alessandro Marinho and Júnior Hélio Vitoriano Nobre. Preventive Activity of an Arginine-Based Surfactant on the Formation of Mixed Biofilms of Fluconazole-Resistant
