TN-seq rewolucjonizuje badania nad Cryptococcus neoformans

Jak TN-seq rewolucjonizuje badania nad Cryptococcus neoformans?

Badanie wykorzystujące sekwencjonowanie mutagenezy transpozonowej (TN-seq) zostało przeprowadzone w celu identyfikacji genów niezbędnych dla patogenu Cryptococcus neoformans oraz zbadania mechanizmów wrażliwości na flukonazol. Technika TN-seq polega na losowym wprowadzaniu pojedynczych transpozonów do genomu w każdej komórce puli, gdzie insercje w genach niezbędnych powodują śmierć komórek, które są następnie eliminowane z puli.

Patogeny grzybicze stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia ludzkiego, powodując około 3,8 miliona zgonów rocznie. Zakażenia grzybicze są częste u pacjentów z obniżoną odpornością, szczególnie w powiązaniu z epidemią HIV/AIDS. Leczenie zakażeń grzybiczych jest niezwykle trudne ze względu na bliskie pokrewieństwo ewolucyjne patogenów grzybiczych z ich ludzkimi gospodarzami, co sprawia, że wiele potencjalnych inhibitorów wzrostu grzybów jest niedopuszczalnie toksycznych dla ludzi. Obecnie dostępnych jest tylko pięć klas leków przeciwgrzybiczych do leczenia chorób inwazyjnych: azole, echinokandyny, polieny, analog nukleozydu 5FC i stosunkowo nowy lek ibrexafungerp.

Czy identyfikacja genów niezbędnych otwiera nowe możliwości terapeutyczne?

Naukowcy opracowali system TN-seq dla C. neoformans wykorzystując zmodyfikowany transpozon Ds (dissociation) mobilizowany przez transpozazę Ac (activator) z kukurydzy. Wygenerowano bibliotekę insercji o wysokiej gęstości, identyfikując 18,4 miliona odczytów mapujących do 1,75 miliona unikalnych miejsc w genomie, obejmujących sekwencje kodujące 6190 z 6975 wszystkich genów.

Do przewidywania niezbędności genów zastosowano model uczenia maszynowego typu random forest. Model został wytrenowany na zbiorze 1653 genów konserwatywnych z przewidywaną niezbędnością na podstawie ortologów w S. cerevisiae, S. pombe i C. albicans. Ostatecznie przewidziano 1465 genów niezbędnych (21% badanych genów), 5419 genów nieistotnych oraz 91 genów niesklasyfikowanych. Wśród genów niezbędnych zidentyfikowano 302 geny bez ludzkich ortologów, które stanowią potencjalne cele dla rozwoju nowych leków przeciwgrzybiczych.

Zaobserwowano dobrą zgodność między wynikami podejścia TN-seq a istniejącą kolekcją delecji. 76,4% (n = 4139) genów ocenionych jako nieistotne zostało usuniętych w kolekcji, a 92,6% (n = 1357) genów ocenionych jako niezbędne nie znajduje się w kolekcji. Jednakże 23,6% genów (n = 1280) przewidzianych jako nieistotne nie było obecnych w kolekcji delecji, co może wynikać z trudności eksperymentalnych lub znacznych defektów wzrostu.

Czy szlak RIM101 skrywa klucz do wrażliwości na flukonazol?

Badacze wykorzystali bibliotekę TN-seq do oceny wrażliwości/tolerancji mutantów C. neoformans na flukonazol. Zidentyfikowano 398 genów, które były specyficznie wzbogacone lub zubożone w insercje po ekspozycji na lek. Wśród najsilniejszych odkryć znalazły się mutanty w komponentach szlaku RIM101, który nie był wcześniej powiązany z wrażliwością na flukonazol. Z dziewięciu opisanych komponentów tego szlaku, sześć wykazało wrażliwość na flukonazol w badaniu TN-seq, co zostało potwierdzone w testach rozcieńczeniowych.

Szlak RIM101 w C. neoformans odgrywa kanoniczną rolę w wykrywaniu pH i jest ważny dla produkcji otoczki. Interesujące jest, że komponenty szlaku RIM101 są również wymagane do tolerancji flukonazolu w Candida albicans, mimo że szlak Rim w C. neoformans znacznie różni się od tego występującego w linii Ascomycete, do której należy C. albicans.

Jak modyfikacje genetyczne i metabolizm mitochondrialny wpływają na oporność?

Interesującym odkryciem było to, że insercje w regionach regulatorowych genów niezbędnych mogą generować allele o obniżonej funkcji (hipomorficzne). Wykazano, że mutanty z insercjami w regionie 300 par zasad bezpośrednio przed genem ERG11 (cel flukonazolu) były dobrze tolerowane w warunkach kontrolnych, ale były selekcjonowane negatywnie po dodaniu flukonazolu. Badacze wygenerowali ukierunkowane mutanty z insercjami 77 par zasad przed kodonem start ERG11, które były wysoce wrażliwe na flukonazol, podczas gdy insercje 296 par zasad przed genem nie wpływały na oporność.

Analizując geny niezbędne z istotnymi zmianami w częstości insercji w regionie 5′ po ekspozycji na flukonazol, naukowcy zaobserwowali, że utrata funkcji mitochondrialnej generalnie zwiększa oporność komórek na flukonazol. Zjawisko to było specyficzne dla flukonazolu i nie dotyczyło innych powszechnie stosowanych leków przeciwgrzybiczych, takich jak 5-fluorocytozyna czy amfoterycyna B. Jest to zgodne z wcześniejszymi doniesieniami, że rotenon, inhibitor kompleksu I łańcucha transportu elektronów, wykazuje silny antagonizm z flukonazolem.

Jednym z możliwych wyjaśnień tego zjawiska jest to, że spowolnienie metabolizmu mitochondrialnego może umożliwić przesunięcie acetylo-CoA (głównego substratu zarówno dla cyklu TCA, jak i pierwszego etapu syntezy ergosterolu) z wykorzystania w cyklu TCA do wykorzystania w syntezie ergosterolu, co prowadzi do szybszej syntezy ergosterolu nawet przy zahamowaniu Erg11.

Jak zgromadzone dane zmieniają perspektywy leczenia zakażeń?

Jako zasób dla społeczności badaczy C. neoformans, zespół opracował interaktywną aplikację Shiny, która pomaga w nawigacji po danych TN-seq. Aplikacja zawiera dane dla wszystkich genów i umożliwia wizualizację zarówno rozkładu, jak i częstości insercji transpozonów w obrębie genu oraz ich odpowiedzi na selekcję flukonazolem.

Badanie to dostarcza cennych informacji o genach niezbędnych w C. neoformans oraz mechanizmach modulujących wrażliwość na flukonazol. System TN-seq umożliwia szybkie i kompleksowe badanie funkcji genów na skalę genomową, co może przyczynić się do opracowania nowych strategii terapeutycznych przeciwko inwazyjnym zakażeniom grzybiczym, które stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia, szczególnie u pacjentów z obniżoną odpornością.

Podsumowanie

Wykorzystując innowacyjną technikę sekwencjonowania mutagenezy transpozonowej (TN-seq), naukowcy zidentyfikowali 1465 genów niezbędnych dla Cryptococcus neoformans, z czego 302 nie ma ludzkich odpowiedników, co stwarza potencjalne cele dla nowych leków przeciwgrzybiczych. Badania wykazały istotną rolę szlaku RIM101 w modulowaniu wrażliwości na flukonazol, gdzie sześć z dziewięciu komponentów tego szlaku wykazało wrażliwość na lek. Odkryto również, że modyfikacje w regionach regulatorowych genów niezbędnych mogą wpływać na oporność na leki, a utrata funkcji mitochondrialnej generalnie zwiększa oporność komórek na flukonazol. Wyniki badań zostały udostępnione w interaktywnej aplikacji Shiny, umożliwiającej szczegółową analizę danych TN-seq, co może przyczynić się do opracowania skuteczniejszych terapii przeciwko inwazyjnym zakażeniom grzybiczym.